| початок розділу
Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві |
хитрощі майстру
електроніка фізика технології винаходи |
таємниці космосу
таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу |
  |
| Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання) | |||
Навігація: => |
На головну / Каталог патентів / В розділ каталогу / Назад / |
|
ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2080598
СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ активувати Т-лімфоцитів В ОРГАНІЗМІ ЛЮДИНИ
Ім'я винахідника: Фролов Олександр Кирилович [UA]; Шіпітяк Євстахій Григорович [UA]; Негусторова Алла Федорівна [UA]; Лупинос Оксана Віталіївна [UA]; Піскун Марина Миколаївна [UA]
Ім'я патентовласника: Запорізький державний університет (UA)
Адреса для листування:
Дата початку дії патенту: 1992.09.03
Використання: в області медицини і стосується виявлення в організмі людини активованих T-лімфоцитів. Суть винаходу: проводять забір крові з пальця або вени в пробірки з антикоагулянтом, виділяють лімфоцити, отримані лімфоцити використовують для постановки спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана без холодової інкубації ( "негайні розетки") і за кількістю лімфоцитів, прикріпити більше 10 еритроцитів барана, визначають активовані . Спосіб дозволяє підвищити об'єктивність оцінки, спростити визначення і скоротити часи аналізу функціональної активності лімфоцитів, безпосередньо в організмі людини.
ОПИС ВИНАХОДИ
Винахід відноситься до медицини, а саме до імунологічних методів дослідження, і стосується виявлення в організмі людини активованих T-лімфоцитів.
Відомий спосіб визначення T-лімфоцитів в крові, що включає в себе виділення лімфоцитів, додавання до них еритроцитів барана, інкубацію не менше однієї години при температурі 4 o C, приготування препаратів і їх аналіз за кількістю прикріпилися еритроцитів [1] За T-лімфоцити беруть клітини , прикріпити не менше трьох еритроцитів барана. Однак цим методом можна визначати тільки кількість T-лімфоцитів, без визначення їх активності в організмі.
Відомий і спосіб визначення активованих T-лімфоцитів в крові людини, що включає культивування лімфоцитів 48 54 години в живильному середовищі з мітогеном фитогемагглютинином (ФГА), стимулюючим до проліферації в умовах культури переважно T-лімфоцити, введення колхіцину, який зупиняє поділ лімфоцитів на стадії метафази, приготування препаратів хромосом і їх цитогенетичний аналіз [2] Даний метод заснований на аналізі в лімфоцитах, що проходять перші мітотичний поділ, асоціацій акроцентріческіх хромосом, які є цитогенетичним слідом (ознакою) їх попередньої проліферації і міграції з периферичних лімфоїдних органів в організмі людини. За активовані приймаються лімфоцити без асоціацій і з двома асоціюється акроцентриками, що утворилися в результаті серії мітотичних поділів, при яких руйнуються асоціації. Даний метод є досить складним (необхідно культивувати лімфоцити в стерильних умовах, зупиняти поділ клітин колхицином, так як хромосоми можна вивчати тільки на стадії метафази мітозу), малодоступним для масового впровадження (необхідні дефіцитні реактиви, дороге обладнання), а й потрібна певна кваліфікація виконавця ( значення культури клітин, володіння цитогенетичним методом). Даний метод недостатньо об'єктивний, так як в культурі частина лімфоцитів гине і не всі з живих лімфоцитів вступають в мітотичний цикл на період фіксації клітин.
Метою запропонованого способу є підвищення об'єктивності оцінки, спрощення визначення та скорочення часу аналізу функціональної активності лімфоцитів безпосередньо в організмі людини.
Поставлена мета досягається тим, що у відомому способі, що включає визначення активності лімфоцитів по залишковим ознаками їх антігензавісімого активації і проліферації в периферичних лімфоїдних органах, здійснюють спонтанне розеткоутворення з еритроцитами барана без холодової інкубації ( "негайні розетки"), в препараті враховують кількість прикріпилися еритроцитів барана до T-лімфоцитів (авідності), і за кількістю T-лімфоцитів, прикріпити більше 10 еритроцитів барана, визначають активовані.
Порівняльний аналіз заявляється, із прототипом показує, що заявляється спосіб відрізняється від відомого тим, що кількість активованих T-лімфоцитів визначають шляхом аналізу авідності T-лімфоцитів до еритроцитів барана в мазку, приготовленому при постановці спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана без ходової інкубації ( "негайні розетки "). За активовані приймаються T-лімфоцити, прикріпити більше 10 еритроцитів барана. Отже, отриманий зразку лімфоцитів не треба культивувати, крім того, обсяг його може бути мінімальним (0,5 0,6 мл) і дозволяє об'єктивно виділити лімфоцити з цільної крові для розеткових тестів, що значно спрощує метод і робить його доступним для скренірующіх дослідження. Таким чином, заявляється рішення відповідає критерію "новизна".
Відомі технічні рішення постановки методу спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана без холодової інкубації ( "негайні розетки") (2, 4, 5). Однак в зазначених технічних рішеннях (3, 4, 5) не був виділений і функціонально обгрунтований Авідність клас T-лімфоцитів, прикріпив більше 10 еритроцитів барана, що не дозволяло досягти поставленої мети, а саме виділити активовані T-лімфоцити в організмі. Тому способи (3, 4, 5) встановлення та перегляду "негайних розеток" є кількісними, а не якісними.
Невідомі технічні рішення, в яких активність лімфоцитів в крові визначають за кількістю прикріпилися до них еритроцитів барана при негайному способі постановки розеток. Визначення активованих T-лімфоцитів розетковим тестом без їх холодової інкубації за часткою високоавідних до еритроцитів барана лімфоцитів (прикріпити більше 10 еритроцитів барана) в препараті не слід явно з відомого рівня техніки. Виходячи з цього, що заявляється рішення відповідає вимозі "винахідницького рівня".
Пропонований спосіб здійснюють наступним чином. Проводять забір крові з пальця або вени в пробірки з антикоагулянтами, виділяють лімфоцити, доводять їх концентрацію до 2,0 Ч 10 6 клітин на 1 мл поживної суміші, що складається з середовища 199 і 10% ембріональної телячої сироватки, адсорбированной проти еритроцитів барана і людини, інактивованої при 56 o C 30 хв. Потім 0,1 мл отриманої суспензії лімфоцитів змішують з 0,1 мл 0,5% суспензії відмитих еритроцитів барана, розведених в тій же живильному середовищі, що і лімфоцити. Клітини інкубують в термостаті 10 хв при 37 o C, центрифугують при 200 5 хв, фіксують розетки додаванням 0,05 мл 3% розчину глютарового альдегіду (pH 7,2 7,4) протягом 20 хв при кімнатній температурі, відмивають від фіксатора надлишком дистильованої води і центрифугуванням при 1000 об / хв 5 хв. Супернатант видаляють, залишаючи обсяг 0,1 0,2 мл, в якому клітини ретельно ресуспендіруют і готують мазки на знежирених предметних стеклах. Мазки фіксують 5 хв в метанолі, фарбують і мікроскопують. У препараті вивчають до 400 лімфоцитів в чотирьох різних ділянках препарату. Розеткообазующіе лімфоцити групують в три Авідність класу: 1 клас 3 6 прикріпилися еритроцитів барана, 2-й клас 6 10 і 3-й клас більше 10 еритроцитів барана. За часткою останнього класу визначають активовані T-лімфоцити на момент взяття зразка крові на аналіз.
Підставою для твердження, що субпопуляція циркулюючих лімфоцитів, що приєднують більше 10 еритроцитів барана, є субпопуляцією активованих лімфоцитів, є дані про їх певної динаміці у здорових і хворих осіб (див. Таблицю), а й виявлена висока (r 0,8 - 0,9 ) позитивна кореляція цієї частки лімфоцитів з частотою класів лімфоцитів без асоціація і з двома асоціюється акроцентриками. Згідно прототипу зазначені цитогенетические класи лімфоцитів і є активованими антигенами, що утворилися в периферичних лімфоїдних органах після серії мітотичних поділів при імуногенність. Висока позитивна кореляція порівнюваних показників, отриманих різними способами, свідчить про однорідність аналізованих субпопуляцій серед циркулюючих лімфоцитів. Ці субпопуляції входять до складу постпроліфератівного пулу лімфоцитів, знову утворюються в периферичних лімфоїдних органах при иммуногенезе у відповідь на наявні в організмі численні антигени і аутоантигени. Отже, ці лімфоцити є активованими. Після серії мітотичних поділів (6-10 разів), активовані субпопуляції лімфоцитів мігрують з периферичних лімфоїдних органів в загальну циркуляцію і стають доступними для аналізу при взятті крові. При русі хромосом асоціації хромосом руйнуються або їх залишається мінімальна кількість, тобто вони становлять клас лімфоцитів без асоціацій і з двома асоціюється акроцентриками. Крім того, у новоутворених T-лімфоцитах зберігається висока щільність мембранних СД 2-антигенів. Тому вони є високоавідних до еритроцитів барана і при контакті з ними приєднують більше 10 еритроцитів барана. У тривало циркулюють (дні, тижні, місяці) інтактних лімфоцитах щільність СД 2-антигенів знижується, тому що даний стадіодіференцірованний антиген бере участь переважно в процесах антігеннезавісімой активації лімфоцитів. Отже, активований (тимчасово інтактні) T-лімфоцити приєднують менше число (<10) еритроцитів барана.
Частота активованих лімфоцитів серед циркулюючого пулу лімфоцитів залежить від інтенсивності їх освіти в перфіеріческіх лімфоїдних органах, а й від активності і напрямки їх міграції до антигенних патологічним вогнищ, що відображено в наведеній таблиці.
Вивчалася частота активованих лімфоцитів за допомогою заявляється способу і прототипу у наступних контингентів осіб:
- здорові донори 10 осіб;
- онкогенні хворі з ексудативним плевритом канцерозних етіології 9 осіб.
У таблиці представлені результати частоти розеткообразующіх T-лифоцитов, отриманих за способом з холодової інкубації, що характеризують загальну кількість T-лімфоцитів, і без холодової інкубації "негайні розетки", що характеризують субпопуляції T-ліміфоцітов з підвищеною щільністю рецепторів до еритроцитів барана (СД 2 антиген) .
З таблиці видно, що загальна частота "негайних розеток" у всіх зразках лімфоцитів значно менше, ніж частота загальних розеток і відповідає даним Литерат [3] Без холодової інкубації встигають утворити розетки тільки лімфоцити з підвищеною щільністю рецепторів СД 2. Аналіз частоти Авідність класів в крові і плевральному ексудаті показує, що тільки високоавідні T-лімфоцити, котрі належать до третього класу, при негайному способі постановки розеток виявляють характерну для даної імунологічної ситуації динаміку. Так, частота лімфоцитів, прикріпити більше 10 еритроцитів барана в плевральному ексудаті в 1,5 2 і більше разів перевищувала частоту таких лімфоцитів в крові. Подібна динаміка в крові і плазмі була виявлена і для класу лімфоцитів без асоціацій і з двома асоціюється акроцентриками (КЛ 0 + 2).
При корелятивне аналізі частоти КЛ 0 + 2 в крові і плазмі виявлено, що даний цитогенетический показник активності T-лімфоцитів достовірно високо (r 0,82 і 0,85 відповідно) корелює тільки з частотою T-лімфоцитів, приєдналися понад 10 еритроцитів барана в постановці методу розеткоутворення без холодової інкубації.
Такі відмінності активованих T-лімфоцитів в цітоннетіческом і розеткових тестах в крові і плевральному ексудаті виникли за рахунок їх перерозподілу, тобто міграції з крові і депонування в легких, де локалізується потужний антигенний вогнище (метастази пухлини).
У крові здорових донорів середня частота "негайних розеток" і нижче загальних розеток і це зниження відбувалося за рахунок частки високоавідних T-лімфоцитів третього класу. Крім того, між ними і частотою КЛ 0 + 2 була більш тісна позитивна кореляція.
Отримана динаміка частоти високоавідних до еритроцитів барана T-лімфоцитів і їх тісну кореляцію з частотою КЛ 0 + 2 підтверджують їх імунологічну активність. Отже, показник частоти T-лімфоцитів, приєдналися понад 10 еритроцитів барана в тесті "негайних розеток", є функціональним тестом активності циркулюючих T-лімфоцитів. Сумарні показники частоти розеткообразующіх лімфоцитів з холодової і без холодової інкубації залишаються кількісними тестами і достовірно не корелюють з функціональними показниками T-лімфоцитів.
Циркулюючі в організмі T-лімфоцити, що приєднали більше 10 еритроцитів барана, мають велику щільність відповідних рецепторів (СД 2-антигени), як залишковий ознака їх попередньої активації в периферичних лімфоїдних органах. ЦД 2-антиген бере участь в міжклітинних контактах, обумовлюючи антігензавісімого (неспецифічну) проліферацію і диференціювання комітірованних лімфоцитів [6] Його компліментарність до еритроцитів барана, а отже, і зв'язок з ними, випадкова. Про це свідчать дані про збільшення авідності лімфоцитів (числа прикріпилися еритроцитів барана) в процесі їх неспецифічної митогенной стимуляції лектинами в умовах культивування в пробірці, вже через годину після додавання митогена (фитогемагглютинина, конкаванаваліна А, митогена лаконоса) ще у відсутності синтезу ДНК [7, 8]
Отже, збільшення щільності ЦД 2 антигену є ранньою ознакою активації T-лімфоцитів. У периферичних лімфоїдних органах лімфоцити після антигенспецифической і антігеннеспеціфіческой активації трансформуються в бластні клітини з високою щільністю ЦД2-антигену, а отже, і з високою авідності до еритроцитів барана. Потім такі лімфоцити мітотично діляться 6 10 разів і диференціюються в клон антігенреактівние T-лімфоцитів, які залишають лімфоїдний орган, включаючись в пул циркулюючих T-лімфоцитів. Новоутворені T-лімфоцити зберігають високу щільність рецепторів СД 2 і стають доступними для аналізу при взятті зразка крові. В ході подальшого онтогенезу T-лімфоцитів щільність мембранного ЦД2-антигену знижується.
Таким чином, по динаміці високоавідних T-лімфоцитів, прикріпити більше 10 еритроцитів барана, визначають методом "негайних розеток" і оперативно контролюють інтенсивність проліферації і міграції активованих T-лімфоцитів; їх перерозподіл в організмі до місць депонування антигенів; вивчають напруженість імунітету і його корекцію за допомогою иммунотропной терапії.
ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ
1. Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова, С.І. Гончарова та ін. Уніфіковані імунологічні методи обстеження хворих на стаціонарному та амбулаторному етапах лікування. Методичні рекомендації. Київ, 1988, 18 с.
2. А.К. Фролов, В.К. Фролов. Спосіб визначення активованих T-лімфоцитів в крові. А.с. N 1024839 C 01 33/50, 1986, прототип.
3. Г. Фримель. Імунологічні методи / Пер. з нім. М. Медицина, 1987, 472 с.
4. А. Н. Чередеев, Д.В. Пледра, К.К. Столонго. Дослідження спонтанних розеткообразующіх клітин периферичної крові людини. Лаб. справа, 1976, N 6, 350-354 с.
5. Ж. І. Карпова, Е.Н. Мохова, Н.І. Волков. Реакція спонтанного розеткоутворення лімфоцитів, виділених з капілярної крові. Лаб. справа, 1984, N 7, 427-429 с.
6. Клінічна імунологія та алергологія. У 3-х томах. Т. 1. Пер. з нім. / Под ред. Йегера. 2-е изд. перероблене і доповнене. М. Медицина, 1990, 528 с.
7. Ju David, Tar Jan. Heman lymphosyte subpomilation: gigant human red Blood cell rosetfes J. Jmmand. Meth. 1977. v.15 N1. p. 67 76.
8. Richie E. Patchen M. Correlation and lymphocyte commitment achivation. Ceen. Jmnuind. N 73). 1978 v 11. N 1, p. 88 97.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб визначення активованих Т-лімфоцитів в організмі людини, що включає забір крові і виділення з неї лімфоцитів, що відрізняється тим, що здійснюють з отриманими лімфоцитами постановку спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана без холодової інкубації і за кількістю лімфоцитів, прикріпити більше 10 еритроцитів барана визначають активовані Т- лімфоцити в організмі.
Версія для друку
Дата публікації 02.04.2007гг
Коментарі
Коментуючи, пам'ятайте про те, що зміст і тон Вашого повідомлення можуть зачіпати почуття реальних людей, проявляйте повагу та толерантність до своїх співрозмовників навіть у тому випадку, якщо Ви не поділяєте їхню думку, Ваша поведінка за умов свободи висловлювань та анонімності, наданих інтернетом, змінює не тільки віртуальний, але й реальний світ. Всі коменти приховані з індексу, спам контролюється.