початок розділу Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві	хитрощі майстру електроніка фізика технології винаходи	таємниці космосу таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу
Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання)

ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2156465

СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ мікогенной сенсибілізації

Ім'я винахідника: Іванова Л.А .; Ізмерова Н.І .; Позднякова Н.В .; Фролова Я.А.
Ім'я патентовласника: Науково-дослідний інститут медицини праці РАМН
Адреса для листування: 121 359, Москва, Маршала Тимошенко 21, УНЦ, патентне бюро, Євтухову А. Н.
Дата початку дії патенту: 2000.02.01

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до дерматології і внутрішніх хвороб, і може бути використано для діагностики сенсибілізації при захворюваннях шкіри і внутрішніх органів. Беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту, в першу пробірку вносять 0, 3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину, і цю пробірку використовують в якості контрольної, обидві пробірки інкубують при 37 ° С протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури , і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв, дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1 % -ним розчином сафраніну протягом 5 хв, розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану, вважають НТС - позитивні нейтрофіли, і в разі перевищення від 5 до 10% в мазках з першої пробірки в порівнянні з мозком з другої роблять висновок про наявність слабо вираженою, в разі від 10 до 20% - помірною та при перевищенні від 20% і більше - сильно вираженою мікогенной сенсибілізації. Спосіб забезпечує підвищення достовірності діагностики.

ОПИС ВИНАХОДИ

Винахід відноситься до медицини, а саме до дерматології і до внутрішніх хвороб, і може бути використано для діагностики сенсибілізації при захворюваннях шкіри і внутрішніх органів.

Суть винаходу в тому, що беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту; в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину, і цю пробірку використовують в якості контрольної; обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури; і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв; дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв; розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану, вважають НТС - позитивні нейтрофіли, і в разі перевищення від 5 до 10% в мазках з першої пробірки в порівнянні з мозком з другої роблять висновок про наявність слабо вираженою, в випадку від 10 до 20% - помірною та при перевищенні від 20% і більше - сильно вираженою мікогенной сенсибілізації.

Відомі способи діагностики in vitro мікогенной сенсибілізації [1,2] за рівнем визначення антитіл до грибкового антигену.

Їм притаманні такі недоліки. Висока травматичність, так як кров беруть з вени і у великій кількості. Низька інформативність, так як алергічна реакція на грибок рідко протікає по негайному типу в системі гуморального імунітету. Ступінь вираженості рівня сенсибілізації не виявляється.

Як прототип обраний спосіб діагностики [3] сенсибілізації. Йому і притаманні такі недоліки. Метод травматичний. Немає достатньої кількості градацій для діагностики рівня сенсибілізації.

У запропонованому винаході вирішені наступні завдання: знижена травматичність забору матеріалу для дослідження; підвищена вірогідність діагностики і частота кореляції з шкірними пробами, з грибковим антигеном і виразністю спостерігається клінічної картини; збільшена точність трьох градацій ступеня вираженості рівня сенсибілізації in vitro.

Зазначена задача вирішена тим, що беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту; в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину і дану пробірку використовують в якості контрольної; обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури; і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв, дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% - -ним розчином сафраніну протягом 5 хв; розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану, вважають НТС - позитивні нейтрофіли, і в разі перевищення від 5 до 10% в мазках з першої пробірки в порівнянні з мозком з другої роблять висновок про наявність слабо вираженою, в випадку від 10 до 20% - помірною та при перевищенні від 20% і більше - сильно вираженою мікогенной сенсибілізації. Спосіб виконують в такій послідовності. Беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия. Якщо менше 0,1% тетразолия, то не у всіх клітинах крові пройде реакція; якщо більше 0,1% тетразолия, то частина барвника випадає в осад на склі та істотно знизиться і не буде виявлено достатньої кількості градацій для оцінки рівня сенсибілізації.

Здійснюють забір крові з пальця у обсязі 0,3 мл. Даний обсяг не перевищують, так як для подальшого аналізу потрібна менша кількість крові.

Вносять в зазначені 2 пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту. Значення 0,1 мл крові оптимально для реакції змішування з раніше введеним в пробірки в якості реагенту і в обсязі і 0,1 мл нітросинім тетразолия.

В першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного грибкового антигену. Обсяг 0,3 мл оптимальний для змішування з попередніми інгредієнтами. Якщо концентрація грибкового антигену менше 0,1%, то утруднене прояв цитохимического ефекту. Якщо концентрація зазначеного антигену більше 0,1%, то в реакції з нитросиним тетразолием пригнічується біохімічна активність клітини.

У другу пробірку додають 0,3 мл стандартного фізрозчину. Дану пробірку надалі використовують як контрольну.

Обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв. Проведення інкубації за час менше 30 хв не забезпечує виявлення реакції в клітинах. Час більше 30 хв не покращує показників реакції, але призводить до деякої пошкоджуваності клітин.

Після закінчення 30 хв інкубації обидві пробірки охолоджують до нормальної кімнатної температури.

Центрифугують дві зазначені пробірки при частоті обертання 1000 об / хв протягом 5 хв.

Якщо швидкість обертання менше 1000 об / хв, то спостерігається недостатнє розділення на фракції.

При швидкості обертання понад 1000 об / хв може спостерігатися травматизація клітин. Час центрифугування менше 5 хв призводить до недостатнього розподілу клітин. Якщо центрифугувати більше 5 хв, то пошкоджуються клітини субстрату.

З верхнього або середнього шарів суспензій, отриманих в першій і в другій пробірці, готують мазки. Дані мазки, зроблені з середнього шару, доповнюють обсяг досліджуваного матеріалу. Мазки, приготовані з верхнього шару, служать основним діагностичним матеріалом. Дані мазки фіксують метиловим спиртом 10 хв. Якщо час фіксації менше 10 хв, то не буде збережена структура клітин. Тривалість фіксації більше 10 хв призводить до інгібіції біохімічних вільно радикальних процесів в клітинах.

Дофарбовують мазки з першої і другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв. Якщо фарбувати менше 5 хв, то залишаються непрокрашенних окремі структури клітин. Час забарвлення більше 5 хв призводить до перефарбуванню мазка.

Вважають НСТ-позитивні нейтрофіли, тобто містять забарвлені гранули формазану.

У разі перевищення вмісту НСТ-позитивних нейтрофілів від 5 до 10% в мазках з першої пробірки в порівнянні з мозком з другої, роблять висновок про наявність слабо вираженою сенсибілізації. У разі перевищення від 10 до 20% і в мазках з другої пробірки в порівнянні з першою роблять висновок про помірно вираженою сенсибілізації. У разі перевищення числа нейтрофілів на 20% і більше знаходять сильно виражену мікогенной сенсибілізацію.

Приклад 1. Хвора С., 45 років. Процес локалізується в складках між 4 і 3, 4 і 5 пальцями стоп, характеризується незначними еритематозно-шелушащимися вогнищами, що супроводжуються слабким сверблячкою. Проводять імуно-цитохимические дослідження для виявлення мікогенной сенсибілізації. Для цього беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту; в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину і дану пробірку використовують в якості контрольної; обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури; і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв; дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв; розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану, НСТ-позитивні нейтрофіли в мазках крові з першої і другої пробірок. В мазках з першої пробірки зміст НСТ-позитивних нейтрофілів становить 19%. В мазках з другої пробірки зазначені нейтрофіли складають 11%. Різниця НСТ-позитивних нейтрофілів в досліджуваних на алергічну реакцію мазках і в контролі становить 8%. Роблять висновок про наявність слабо вираженою мікогенной сенсибілізації.

Приклад 2. Хвора Н., 35 років. Нігтьові пластинки 5 пальця стоп жовтуватого кольору, деформовані, кришаться, відзначається піднігтьового гіперкератоз. На шкірі 4-й міжпальцевих складки стоп спостерігається набрякла еритема з мацерацією, мікровезікуляціей, що супроводжується відчуттями свербіння і печіння. Беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту; в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину і дану пробірку використовують в якості контрольної; обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури; і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв; дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв; розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану. Вважають НСТ-положітельниве нейтрофіли в мазках крові з першої і другої пробірок. В мазках з першої пробірки активність НСТ-позитивних нейтрофілів становить 29%. В мазках з другої пробірки активність 12% відповідно. Різниця показників активності становить 17%. Діагностують помірну мікогенной сенсибілізацію.

Приклад 3. Хвора М., 47 років. Нігтьові пластинки всіх пальців стоп деформовані, потовщені, сіруватою тьмяною забарвлення. У міжпальцевих складках тріщинки з чітким лущенням навколо. Шкіра підошов суха, на тлі застійної еритеми відзначаються складки з муковідним лущенням. Суб'єктивно турбує свербіж. Хворому призначено цитохимические дослідження НСТ-тесту з грибковим антигеном. Беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0,1 мл крові з додаванням антикоагулянту; в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину і дану пробірку використовують в якості контрольної; обидві пробірки інкубують при 37 ^{o C} протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури; і обидві пробірки центрифугують при 1000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як першої, так і другої пробірок готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв; дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв; розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану. Вважають НСТ позитивні нейтрофіли мазка. Визначають в мазках з першої пробірки 41% зазначених нейтрофілів; в мазках з другої - контрольної пробірки, розраховані дані становлять 15%. Різниця числа забарвлених нейтрофілів в мазках з першої і другої пробірок становить 26%. Діагностують сильно виражену мікогенной сенсибілізацію. Діагноз підтверджений при мікроскопічному дослідженні, в якому в соскобах нігтьових пластинок був виявлений міцелій патогенного гриба.

ефективність способу

1. Знижена травматичність забору матеріалу для дослідження. Беруть всього 0,1 мл крові з пальця. У всіх існуючих методах здійснюють забір крові з вени, що травматично. Виникає ризик інфекційних ускладнень.

2. Підвищена достовірність аналізу, так як проведена диференціація ступеня вираженості рівня сенсибілізації за трьома градаціях.

3. Результати проведення лікувальних заходів (табл) підтверджують ефективність.

ВИКОРИСТОВУВАНА ЛІТЕРАТУРА

1. Кишкин П.М. Дерматомікози. Л. 1954.

2. Кассирский І.A. Алексєєв Г.А. Клінічна гематологія. М. 1970. Наступні

3. Адо А.Д. Загальна алергологія. М. 1970. Наступні

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

Спосіб діагностики мікогенной сенсибілізації шляхом проведення цитохімічної реакції, що відрізняється тим, що беруть 2 конусоподібні пробірки, в кожну вносять по 0,1 мл 0,1% -ного водного розчину нітросинім тетразолия, здійснюють забір крові з пальця і ​​вносять в зазначені пробірки по 0, 1 мл крові з додаванням антикоагулянту, в першу пробірку вносять 0,3 мл 0,1% -ного розчину грибкового антигену, а в другу пробірку додають 0,3 мл фізрозчину, і цю пробірку використовують в якості контрольної, обидві пробірки інкубують при 37 ^o C протягом 30 хв, а потім охолоджують до нормальної кімнатної температури, і обидві пробірки центрифугують при 10000 об / хв протягом 5 хв, після чого з верхнього або середнього шарів суспензії клітин, як перший, так і другий пробірок, готують мазки, фіксують метиловим спиртом 10 хв, дофарбовують мазки з першої і з другої пробірок 1% -ним розчином сафраніну протягом 5 хв, розглядають і оцінюють пофарбовані нейтрофільні лейкоцити, що містять в цитоплазмі темно-сині гранули формазану, вважають НТС - позитивні нейтрофіли, і в разі перевищення від 5 до 10% в мазках з першої пробірки в порівнянні з мозком з другої роблять висновок про наявність слабо вираженою, в разі від 10 до 20% - помірною та при перевищенні від 20% і більше - сильно вираженою мікогенной сенсибілізації.

Версія для друку
Дата публікації 01.04.2007гг

НОВІ СТАТТІ ТА ПУБЛІКАЦІЇ
	Технологія виготовлення універсальних муфт для бесварочного, безрезьбовиє, бесфлянцевого з'єднання відрізків труб в трубопроводах високого тиску (мається відео)
	Технологія очищення нафти і нафтопродуктів
	Про можливість переміщення замкнутої механічної системи за рахунок внутрішніх сил
	Світіння рідини в тонких діелектричних каналох
	Взаємозв'язок між квантової і класичної механікою
	Міліметрові хвилі в медицині. Новий погляд. ММВ терапія
	магнітний двигун
	Джерело тепла на базі нососних агрегатів