| початок розділу
Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві |
хитрощі майстру
електроніка фізика технології винаходи |
таємниці космосу
таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу |
  |
| Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання) | |||
Навігація: => |
На головну / Каталог патентів / В розділ каталогу / Назад / |
|
ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2200954
СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ ПЕРЕБІГУ ХРОНІЧНОГО ГЕПАТИТУ В
У ХВОРИХ НА гемобластозі
Ім'я винахідника: Овсянникова Є.Г .; Заклякова Л.В.
Ім'я патентовласника: Овсяннікова Олена Георгіївна
Адреса для листування: 414000, г.Астрахань, вул. Бакинська, 121, АГМА, інженеру- патентознавців С.А.Голубкіной
Дата початку дії патенту: 2001.01.09
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до гастроентерології та гематології. Спосіб забезпечує підвищення точності прогнозування особливостей перебігу хронічного гепатиту В у хворих гемобластозами. Проводять імуногенетичні дослідження, при цьому в венозної крові визначають антигени локусів А, В, С системи HLA і при наявності антигену HLA-B35 прогнозують хронічний гепатит В і гемобластози, при наявності антигену HLA-B40 прогнозують хронизацию гепатиту В, при наявності гаплотипу А2 / В27 прогнозують резистентність до інфікування вірусом гепатиту В.
ОПИС ВИНАХОДИ
Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до гастроентерології та гематології, і може бути використано, зокрема, для прогнозування особливостей перебігу хронічного гепатиту В (ХГВ) у хворих гемобластозами.
З практики медицини відомий тільки один спосіб прогнозування хронічного гепатиту В (Сочнев А.М., Алексєєв Л.П., Тананов А.Т. Антигени системи HLA при різних захворюваннях і трансплантації. - Рига: Зінатзе, 1987 р - 86с.) , що полягає у визначенні антигенного профілю системи HLA.
Недоліком цього способу є те, що спосіб відомий тільки у хворих на хронічні дифузні захворювання печінки (ХДЗП). Хворі гемобластозами з хронічним гепатитом В має суттєві відмінності від хворих ХДЗП (стан імуносупресії, безліч переливань крові, масивна медикаментозне навантаження) і застосувати відомий спосіб прогнозування ХГВ, не представляється можливим.
Мета пропонованого винаходу: підвищення точності прогнозування особливостей перебігу хронічного гепатиту В у хворих гемобластозами.
Поставлена мета у винаході можливою завдяки тому, що в венозної крові визначають антигени локусів А, В, С системи HLA і при наявності антигену HLA-B35 прогнозують хронічний гепатит В і гемобластози; при наявності антигену HLA-B40 прогнозують хронизацию гепатиту В; при наявності гаплотипу А2 / В27 прогнозують резистентність до інфікування вірусом гепатиту В.
Успіхи в діагностиці та лікуванні вірусних гепатитів, досягнуті за останнє десятиліття, показали важливість ранньої діагностики, можливість лікування і прогнозування результатів гепатитів.
Прогнозування характеру перебігу та результатів захворювань є важливим напрямком сучасної медицини. Одним з достовірних способів, що дозволяють визначити схильність і особливості перебігу захворювання, є дослідження антигенів системи HLA.
Хворі гемобластозами є особливою групою хворих, для якої проблема прогнозування перебігу особливостей хронічного гепатиту виходить на одне з провідних місць. Хронічний гепатит В у хворих гемобластозами часто нашаровується на вже наявні специфічне і лікарське ураження печінки. Рання діагностика гепатиту В не може відсутністю яскравою клінічної симптоматики, основні клініко-лабораторні синдроми хронічного гепатиту В перекриваються клінікою лейкозу. Стан імуносупресії сприяє розвитку латентних субклінічних форм хронічного гепатиту В. У той же час, ризик зараження вірусом гепатиту В у хворих гемобластозами досить великий внаслідок масивної гемотрансфузійних навантаження і безлічі інвазивних втручань. Таким чином, це дає підставу для застосування способу прогнозування особливостей перебігу хронічного гепатиту В при гемобластозах.
Представленим способом апробовано 106 хворих гемобластозами на базі гематологічного відділення Олександро-Маріїнської I обласної клінічної лікарні м Астрахані в період з 1996 по 2000 роки.
При обробці отриманих результатів були застосовані методи медичної статистики. Для оцінки результатів типування антигенів HLA обчислювалися частоти антигенів, на основі закону Харді-Вайнберга. Для визначення показника достовірності результатів був використаний непараметричний критерій - X 2.
Критерій X 2 обчислювався за формулою Holdene, враховуючи малий обсяг вибірок, була застосована модифікована формула з поправкою Іейтса. Значення Х 2, що перевищують 3,841 (що відповідає р <0,05) розглядався, як показник достовірної різниці між частотами в порівнюваних групах. Для підвищення точності дослідження проводилася корекція значення "р" за способом Бонферроні (тобто множенням величини "р" на число антигенів).
Крім показника статистичної достовірності, використовувався показник сили асоціації - RR (relative risk) - відносний ризик. Величина RR, рівна 1, вказує на відсутність асоціації. RR> 1 (позитивна асоціація), означає, що антиген частіше зустрічається у хворих; якщо RR <1, це вказує на зниження частоти антигену у хворих. При обчисленні RR, враховуючи малий обсяг вибірок, була застосована модифікована формула для малих вибірок.
Частоти гаплотипов HLA обчислювалися непрямим методом, з використанням показника ступеня нерівноважного зчеплення за формулою Маттіуса.
Всі розрахунки проводилися на персональному комп'ютері IBM Pentium-100, з використанням стандартних статистичних програм.
106 хворих гемобластозами російської національності, які перебували на лікуванні в гематологічному відділенні I ОКБ пройшли повне клініко-лабораторно-інструментальне обстеження на виявлення ознак ураження печінки вірусом гепатиту В. Формування групи відбувалося з використанням методу випадкового підбору, в дослідження включалися як хворі, які мають ознаки ураження печінки (підвищення рівня АЛТ, білірубіну, гепатомегалія), так і хворі, у яких даних симптомів не спостерігалося. Всім хворим даної групи проводилося типування антигенів системи HLA методом комплементзавісімой цитотоксичности. Контрольна група - 200 здорових донорів російської національності жителів Астраханської області та 30 хворих російської національності ХДЗП HBsAg +.
На фіг. 1 представлений порівняльний аналіз відмінності частоти реєстрації антигенів HLA у хворих гемобластозами з маркерами HBV-інфекції та без маркерів. В результаті проведеного аналізу встановлено, що у хворих гемобластозами, які мають маркери HBV, є достовірне підвищення антигенів HLA-A10, A28, В21, В22, В35, В40. Антиген-НLА-В27: достовірно підвищений у хворих гемобластозами без HBV. Так як хворі даної групи мають два основних захворювання - гемобластози і вірусний гепатит В, нами зроблена спроба визначити, яке саме захворювання маркують дані антигени або має місце описана багатьма авторами здатність одного антигену HLA бути маркером декількох захворювань. Нами було проведено аналіз розподілу антигенів HLA у хворих ХДЗП HBsAg + і у хворих гемобластозами, які мають маркери HBV.
Як випливає з фиг.2, найбільший відсоток виявлення в обох групах має антиген HLA-B35. Антиген HLA-B18 виявлено тільки в групі ХДЗП. Антиген HLA-B40 тільки в групі гемобластозів плюс HBV-інфекція. В результаті аналізу встановлено, що антигени HLA-B35, В40 маркують ризик виникнення HBV-інфекції у хворих гемобластозами. Для більш глибокого аналізу цього твердження і виявлення клініко-діагностичних критеріїв вірусного гепатиту В у хворих гемобластозами, ми провели порівняльний аналіз розподілу антигенів HLA у даних хворих з ХВГ і хворих, що мають тільки HBsAb.
На фіг. 3 показано, найбільші відмінності виявлені за антигенами HLA-B35, В40: є достовірно значуще підвищення частоти реєстрації даних антигенів в групі хворих гемобластозами плюс хронічний вірусний гепатит В і відсутність достовірного відмінності в групі хворі гемобластозами, які перенесли вірусний гепатит В. Є достовірне підвищення частоти реєстрації антигену HLA-A28, B22 у хворих гемобластозами з хронічним гепатитом В і немає достовірного підвищення відсотка виявлення даного антигену у хворих, які перенесли вірусний гепатит В. Таким чином нами виявлено, що ХГВ у хворих гемобластозами розвивається при наявності антигенів HLA-A28, В22, В35 , В40.
Для виявлення більш тонких відмінностей між групами досліджуваних хворих були проаналізовані відмінності за гаплотипом HLA.
З таблиці випливає, що резистентність до HBV-інфекції у хворих гемобластозами маркується гаплотипом А2 / В27 (частота гаплотипу Н = 84,7).
Нижче наводяться результати апробації.
приклад 1
Хворий Г. історії хвороби 1421. Вступив у відділення 30.01.97 зі скаргами на слабкість, нездужання, лихоманку, болі в кістках, тяжкість в правому підребер'ї. При обстеженні виявлена анемія, що вимагає уточнення. Було проведено типування антигенів системи HLA I класу локусів А, В, С за допомогою лімфоцітотоксічесской реакції, запропонованої в 1964 році Терасакі.
Реакція грунтується на двоетапному впливі на лімфоцити периферичної крові: 1 - імунної сироватки, що містить антитіла відомої специфічності; 2 - комплементу. Для виявлення антигенів HLA були використані набори сироваток антілейкоцітарних гістотіпірующіх до антигенів I класу (панелі N 36 та N 37 для локусів А, В, С) і комплемент кролячий ліофілізований. Реакція проводилася за допомогою спеціального мікрооборудованія: мікрошпріцем Гамільтона об'ємом 25 мікролітрів з механічним дозатором; планшет Терасакі для імунологічних реакцій; пластикових пробірок об'ємом 1 і 2 мілілітра. Для проведення реакції попередньо проводилося розкопування під вазелінове масло в лунки планшет Терасакі по 5 мікролітрів антисироваток. Підготовлені таким чином планшети заморожували і зберігали до моменту використання в морозильній камері при температурі -20 o С. Безпосередньо перед постановкою реакції сироватки розморожували при кімнатній температурі. В ході реакції використовувалися розчин верографін - фікола і барвник - 5% розчин еозину. Верографін - фіколовий градієнт готували наступним чином: змішували 9% водний (на дистильованої воді) розчин фікола, молекулярна маса 400000 і 32,8% водний розчин верографина (верографін 60%) в співвідношенні 10:24. Отриманий верографін-фіколовий розчин повинен був мати щільність 1,076-1,077. Барвник - 5% розчин еозину в дистильованої воді змішували перед використанням в співвідношенні 4: 1 з 4,26% гіпертонічним розчином хлористого натрію.
Реакція може бути виконана кількома методами, з яких був застосований найбільш використовуваний - "двоступеневий метод", запропонований Національним інститутом здоров'я в Бетезда (NIH-метод).
Виділення лімфоцитів: венозну кров об'ємом 5-6 мл дефібринованої в контейнері з плоским дном, що містить скляні намистинки d-6 мм рівномірним струшуванням протягом 10-15 хвилин; в центрифужную пробірку поміщали 2 мл розчину верографін-фікола; 4 мл дефибринированной крові, змішаної в рівних кількостях з фізіологічним розчином, обережно нашаровуються на розчин верографін-фікола; центрифугировали 20 хвилин при 1500 об / хв; утворилося "хмарка" лімфоцитів (біле кільце між градієнтом щільності і надосадочной рідиною) переносили в чисту пробірку; додавали до суспензії лімфоцитів 5 мл розчину Хенкса і центрифугували при 1500 об / хв протягом 10 хвилин для відмивання від суміші верографін-фікола; відмивання повторювали двічі; видаливши надосадову рідину концентрацію суспензії лімфоцитів доводили до 2-4 Ч 10 3 в 1 мкл за допомогою розчину Хенкса. Постановка реакції: пробірку з лімфоцитарною суспензією струшували; за допомогою микрошприца Гамільтона вносили по 1 мкл суспензії лімфоцитів суспензія в лунки планшет Терасакі, що містять гістіотіпірующіе сироватки (розморожені безпосередньо перед проведенням реакції); інкубували при кімнатній температурі протягом 45 хвилин; додавали в кожну лунку по 4-5 мкл стандартного кролячого комплементу; інкубували в темному місці при кімнатній температурі протягом 1 години; планшети різко струшували для видалення вазелінового масла; додавали в кожну лунку по 1 мкл 5% розчину еозину; через 6-7 хвилин планшети струшували для видалення надлишку барвника; проводили оцінку результатів з використанням мікроскопа Биолам при збільшенні 10 Ч 20.
Оцінка реакції проводилася за співвідношенням токсірованних (профарбованих) і нетоксірованних (блискучих) лімфоцитів в полі зору мікроскопа. Якщо лімфоцити, що несуть певний HLA-антиген, "розпізнаються" сироваткою, то відбувається реакція клітинного лізису, яка визначається по проникненню барвника в клітини. Інтенсивність реакції оцінювалася за наступними критеріями: 100% -90% загибель клітин - різко позитивна (++++); 75% -50% загибель клітин - позитивна (+++); 50% -25% загибель клітин - слабо позитивна (++); 25% -10% загибель клітин - результат сумнівний (- +). Негативним конролем служили результати реакції взаємодії лімфоцитів з нетоксической сироваткою осіб IV групи крові, яка не містить анти-HLA антитіла, позитивним - результати реакції з антилімфоцитарну сироваткою.
При оцінці результатів враховувався принцип "батарейних". Використання декількох імунних сироваток різних серій підвищує точність отриманих результатів і зменшує ймовірність помилки.
В результаті у хворого був визначений антигенний профіль HLA-A3A9B12B35. Наявність антигену HLA-B35 дозволило прогнозувати у хворого гемобластози і хронічний гепатит В. Надалі на підставі дослідження кісткового мозку, аналізів крові і цитохімічних реакцій хворому був виставлений діагноз гострого лімфобластного лейкозу. Було призначено лікування за протоколом Хельцера (1994 г.). Проведено комплексне дослідження на виявлення ознак ураження печінки (дослідження маркерів вірусу гепатиту В методом ІФА в сироватці крові, біохімічне дослідження крові, УЗД). Ознак ураження печінки виявити не вдалося. Протягом курсової поліхіміотерапії хворий отримав більше 30 гемотрансфузій. При повторному дослідженні сироватки крові протягом 6 місяців у хворого виявлено HBsAg, HBcAb, ABeAb, збільшення рівня трансаміназ в 2 рази, рівень білірубіну в межах норми, УЗД-печінки визначило дифузне ущільнення паренхіми печінки. При расспросе хворий пред'являв колишні скарги. Перераховані клініко-лабораторні синдроми послужили підставою для діагностики хронічного гепатиту В.
Таким чином, імуногенетичні дослідження дозволило прогнозувати гемобластози і хронічний гепатит В при наявності антигену HLA-B35.
Приклад 2. Хворий Б. історії хвороби 854. Вступив у відділення 20.01.97. Спостерігається з 1988 року з діагнозом хронічний лімфолейкоз. Специфічне лікування отримує 2-3 рази на рік. За весь період лікування отримав понад 50 гемотрансфузій. При включенні хворого в групу обстеження пред'являв скарги на слабкість, болі в кістках, суглобах, періодично тяжкість в правому підребер'ї, в епігастрії. З анамнезу: рік тому переніс гострий вірусний гепатит В (з характерною клінікою, жовтяницею, підвищенням рівня трансаміназ в 5 разів, підвищення рівня білірубіну в 2 рази, в сироватці крові реєструвався HBsAg). При імуногенетичному дослідженні (опис методики - приклад 1) у хворого визначений антигенний профіль HLA-A1A9B15B40, що дозволило прогнозувати у хворого ймовірність хронізації гепатиту В.
При обстеженні: підвищення рівня трансаміназ у 1,5 разів, рівень білірубіну не змінений. Визначено маркери вірусу гепатиту В методом ІФА: HBsAg, НВсАb, НВеА. УЗД печінки: паренхіма печінки дифузно ущільнена. Спостереження за хворим протягом наступних 6 місяців, з неодноразовим контролем маркерів вірусного гепатиту В дозволило встановити діагноз хронічного вірусного гепатиту В. Таким чином, імуногенетичні дослідження дозволило прогнозувати хронизацию гепатиту В при наявності антигену HLA-B40.
Приклад 3. Хворий Т. історії хвороби 5676. Вступив у відділення 18.04.97. Спостерігається в гематологічному відділенні протягом 2 років з діагнозом множинна мієлома. За період лікування отримав понад 50 гемотрансфузій і 6 курсів поліхіміотерапії. Проведено комплексне дослідження на виявлення ознак ураження печінки (дослідження маркерів вірусу гепатиту В методом ІФА в сироватці крові, біохімічне дослідження крові, УЗД). Ознак ураження печінки виявити не вдалося. При імуногенетичному дослідженні (опис методики - приклад 1) у хворого визначений антигенний профіль HLA-A2A19B12B27 (мається гаплотип А2 / В27), що дозволило прогнозувати у хворого резистентність до зараження вірусом гепатиту В. При спостереженні за хворим протягом 1 року з неодноразовим контролем маркерів вірусу гепатиту В, факту зараження вірусом гепатиту В не виявлено. Таким чином, імуногенетичні дослідження сприяло прогнозуванню резистентності до зараження вірусом гепатиту В хворого при наявності безлічі факторів ризику (стан імуносупресії, велика кількість гемотрансфузій, масивна медикаментозне навантаження).
Пропонованим способом досягнуто підвищення точності прогнозування особливостей перебігу хронічного вірусного гепатиту В у хворих гемобластозами.
Перевагами способу є його висока вірогідність, простота лабораторного виконання, що вказує на можливість широкого застосування в гастроентерологічних, гематологічних стаціонарах, онкологічних клініках.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб прогнозування особливостей перебігу хронічного гепатиту В у хворих гемобластозами шляхом імуногенетичної дослідження, що відрізняється тим, що в венозної крові визначають антигени локусів А, В, С системи HLA і при наявності антигену HLA-B35 прогнозують хронічний гепатит В і гемобластози, при наявності антигену HLA- B40 прогнозують хронизацию гепатиту В, при наявності гаплотипу А2 / В27 прогнозують резистентність до інфікування вірусом гепатиту В.
Версія для друку
Дата публікації 30.03.2007гг
Коментарі
Коментуючи, пам'ятайте про те, що зміст і тон Вашого повідомлення можуть зачіпати почуття реальних людей, проявляйте повагу та толерантність до своїх співрозмовників навіть у тому випадку, якщо Ви не поділяєте їхню думку, Ваша поведінка за умов свободи висловлювань та анонімності, наданих інтернетом, змінює не тільки віртуальний, але й реальний світ. Всі коменти приховані з індексу, спам контролюється.