початок розділу Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві	хитрощі майстру електроніка фізика технології винаходи	таємниці космосу таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу
Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання)

ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2088938

СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ КИШЕЧНОГО ДИСБІОЗУ І КИШКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ

Ім'я винахідника: Бухарін О.В .; Валишев А.В .; Зикова Л.С .; Коннова М.Є .; Соколов В.Ю .; Челпаченко О.Е.
Ім'я патентовласника: Оренбурзький відділ персистенції мікроорганізмів Інституту екології та генетики мікроорганізмів Уральського відділення РАН
Адреса для листування:
Дата початку дії патенту: 1993.07.01

Спосіб виявлення кишкового дисбіозу і кишкової інфекції. Використання: в області медичної мікробіології, а саме в лабораторній діагностиці порушень мікробіоценозу кишечника. Суть винаходу: виявляють у виросли на живильному агарі при посіві фекалій колоній ентеробактерій здатність інактивувати комерційний препарат людського лейкоцитарного інтерферону в концентрації 2 МБК для тест-культури Corynebacterium xerosis ГИСК N 181. При цьому відсутність антіінтерфероновой активності у вирослих колоній свідчить про еубіоза; виявлення ознаки у 1-50% колоній вказує на кишковий дисбіоз, а наявність ознаки у понад 50% колоній - на кишкову інфекцію. Спосіб дає можливість здійснювати ранню діагностику кишкового дисбіозу і кишкової інфекції за рахунок скорочення термінів і підвищення інформативності досліджень шляхом попередньої орієнтовної оцінки стану кишкової мікрофлори. Спосіб може бути використаний як для виконання масового скринінгу з метою визначення груп ризику, так і для проведення диференціального діагнозу різних станів мікробіоценозу кишечника в складних клініко-бактеріологічних ситуаціях.

ОПИС ВИНАХОДИ

Винахід відноситься до медицини, зокрема до медичної мікробіології, і може бути використано для діагностики кишкового дисбіозу і кишкової інфекції.

В останні роки повсюдно відзначається значне зростання захворюваності кишковою дисбиозом (дисбактеріозом), який є джерелом гострих ендогенних інфекцій (перитоніт, апендицит, холецистит, пієлонефрит, пневмонія), сприяє розвитку алергічних захворювань, формування і прогресування хронічних запальних процесів в різних органах. Мікрофлора кишечника при кишковому дисбіозу грає роль в канцерогенезі, розвитку атеросклерозу, є джерелом генів антибіотикорезистентності, здатних передаватися іншим бактеріям.

У зв'язку з високою поширеністю кишкового дисбіозу питання своєчасного його розпізнавання стає одним із завдань діагностичної служби. Для виявлення кишкового дисбіозу, як відомо, застосовується розширене бактеріологічне дослідження фекалій класичним способом з визначенням кількості і біологічних властивостей анаеробної мікрофлори (Епштейн-Литвак Р. В. та ін. Бактеріологічна діагностика дисбактеріозу кишечника: Методичні рекомендації. М. 1977). Надзвичайне різноманіття кишкової мікрофлори (у вмісті сліпої кишки знаходяться представники 17 родин, 45 родів і понад 400 різних видів) вимагає великого набору поживних середовищ і створення особливих умов культивування мікроорганізмів. Це призводить до того, що лабораторні методи діагностики дисбіозу кишечника до теперішнього часу залишаються дорогими, трудомісткими, тривалими і неприйнятними для проведення масових досліджень.

На підставі вищевикладеного можна зробити висновок про важливість раннього виявлення кишкового дисбіозу для своєчасного та ефективного проведення корекції мікрофлори біо- і Іммунопрепарат. Для вирішення такого завдання потрібні програми по скринінгу населення на предмет кишкового дисбіозу.

Оскільки при порушенні кишкового біоценозу все властивості, мікрофлори (антагоністична і вітамінообразующая активність, участь в метаболічних процесах і ін.) Значно змінюються, запропоновані різні непрямі тести діагностики кишкового дисбіозу. Так, про стан мікробіоценозу судять за рівнем метаболітів кишкової мікрофлори. З цією метою визначають индикан, п-крезол та фенол в сечі; водень і метан в повітрі, що видихається; летючі жирні кислоти у вмісті тонкої кишки або в фекаліях; аміак в крові, в калі або в повітрі, що видихається (Тамм А.О. та ін. Метаболіти кишкової мікрофлори в діагностиці дисбіозу кишечника. Антибіотики і медична біотехнологія. 1987, т. 32, N 3, с.191-195). Методи виявлення кишкового дисбіозу, засновані на виявленні продуктів метаболізму, дають задовільні результати при вираженому дисбалансі кишкової мікрофлори і мають малу чутливість і діагностичну цінність в початковій стадії кишкового дисбіозу (там же, с. 192). Отже, ці методи недостатні для проведення скринінгових досліджень населення на дисбіоз кишечника. В основу іншого методу виявлення дисбіотичних порушень покладено ступінь антагоністичної активності мікроорганізмів, виділених з фекалій (Завгородня Е.Ф. і ін. Антагоністична активність кишкової аутофлори як непрямий метод виявлення дисбактеріозу кишечника. Лікарська справа. 1981, N 6, с.113-116) . Недоліком даного методу оцінки стану кишечника мікрофлори є тривалість дослідження (5 діб).

У зв'язку з викладеними вище обставинами пошук нових методів скринінгової діагностики кишкового дисбіозу є актуальним завданням клінічної мікробіології. При проведенні масових обстежень населення, особливо дитячого, на виявлення дисбіозу кишечника важливе значення має диференціювання останнього зі спорадичними випадками кишкових інфекцій. В даний час відсутні чіткі клінічні та мікробіологічні критерії диференціації цих двох захворювань. Існуючі лабораторні методи діагностики кишкових інфекцій, викликаних умовно-патогенними ентеробактеріями (УПЕ) ешеріхіями, протеями, клебсієлами і ін. Засновані на виявленні їх в кількості не менше 10 ⁶ КУО в 1 г фекалій, оцінці їх біологічних властивостей, наявності антитіл до умовно-патогенних ентеробактеріями в титрі 1:40 і вище з наростанням їх рівня в динаміці захворювання при дослідженні "парних" сироваток (Королева Л. Б. та ін. Клініка, діагностика, лікування, епідеміології та протиепідемічні заходи при гострих кишкових інфекціях, викликаних умовно-патогенними бактеріями у дітей раннього віку: Методичні рекомендації, М. 1988, с.19). Дорожнеча, трудомісткість, тривалість досліджень виключає можливість використання перерахованих методів діагностики кишкових інфекцій, викликаних УПЕ, для проведення скринінгових досліджень. Отже, особливу активність набуває розробка методу бактеріологічного скринінгу, що дозволяє на першому етапі обстеження (пошукова програма) виявляти і проводити диференційний діагноз найбільш поширених інфекційних захворювань кишечника кишкового дисбіозу і кишкової інфекції, викликаних умовно-патогенними бактеріями.

Найбільш близьким технічним рішенням, обраним як прототип, є спосіб визначення кишкового дисбіозу по дефіциту біфідобактерій (посів суспензії фекалій проводиться в середу Блаурокка; облік шляхом мікроскопії забарвлених по Граму мазків, приготовлених з характерних колоній) і виявлення тканинного білка в калі (осадження розчинного білка шляхом додавання трихлороцтової кислоти до емульсії з фекалій; облік візуальна реєстрація ступеня просветвленія надосадової рідини), що вказує на можливе пошкодження клітинних елементів кишкової стінки (Дорофейчук В.Г. та ін. Ключові тести для визначення кишкового дисбактеріозу: Прістендовий листок ВДНГ СРСР. М. 1991 ). Недоліком відомого способу є відсутність можливості діагностики дисбіозу кишечника на ранній стадії, яка характеризується лише незначними змінами в аеробного частини мікробіоценозу (збільшення або зменшення кількості кишкової палички при відсутності зниження рівня біфідобактерій 1 ступінь дисбіозу) (Грачова Н.М. та ін. Застосування бактерійних біологічних препаратів в практиці лікування хворих на кишкові інфекції. Діагностика та лікування дисбактеріозу кишечника: Методичні рекомендації. М. 1986, с. 16-17). Крім того, візуальна оцінка ( "повне", "значне", "незначне" просветвленіе рідини) не дозволяє об'єктивно оцінити і стандартизувати результати.

Викладена вище узагальнена характеристика виявлених способів-аналогів із зазначенням причин, що перешкоджають отриманню необхідного технічного результату, дає підставу зробити висновок, що заявляється винахід не відомо з рівня техніки, тобто є новим.

Істотні відмінності полягають в тому, що визначають антіінтерфероновую активність одномоментно у всіх колоній ентеробактерій в посіві фекалій на живильному агарі з препаратом людського лейкоцитарного інтерферону в концентрації 2 МБК для тест-культури Corinebacterium xerosis ГИСК N 181 і при інактивації інтерферону колоніями роблять висновок про стан кишкового мікробіоценозу : відсутність антіінтерфероновой активності у вирослих колоній свідчить про еубіоза; виявлення ознаки у 1-50% колоній вказує на кишковий дисбіоз, а наявність ознаки у понад 50% колоній на кишкову інфекцію.

Автори вважають, що істотні відмінності є новими і дають можливість здійснювати ранню діагностику кишкового дисбіозу і кишкової інфекції за рахунок скорочення термінів і підвищення інформативності дослідження шляхом попередньої орієнтовної оцінки стану кишкової мікрофлори. Заявляється спосіб може бути використаний як для виконання масового скринінгу з метою визначення груп ризику, так і для проведення диференціального діагнозу різних станів мікробіоценозу кишечника в складних клініко-бактеріологічних ситуаціях.

Спосіб здійснюють наступним чином.

Ректальної петлею роблять посів вмісту прямої кишки на чашки Петрі з 1,5% м'ясо-пептони агаром, що містить препарат людського лейкоцитарного інтерферону (НВО "Іммунопрепарат", м Уфа) в кількості 0,3 мл робочого розчину в 7,5 мл агару, що відповідає концентрації 2 МБК для тест-культури Corynebacterium xerosis ГИСК N 181. Робочий розчин готується відповідно до інструкції розчиненої речовини ампули в 2 мл стерильного 0,85% розчину хлориду натрію. Одночасно на одну чашку допускається посів калу по секторам від двох-трьох обстежуваних. Посіви інкубують в термостаті 18-24 год при 37 ^{o C.} Виросли колонії прибирають парами хлороформу. Для цього, тримаючи чашку перевернутої, вкладають в її кришку шматочок паперу ватман площею 8-10 см ² і просочують його 0,3-0,5 мл хлороформу. Тримають чашку закритою 20-30 хв. Перевертають чашку і зверху на колонії нашаровуються 3-4 мл м'якого (0,6-0,7%) агару, змішаного з 0,1 мл суспензії (в 1 мл близько 10 ⁹ індикаторних клітин по оптичному стандарту мутності) добової агарної тест-культури Corynebacterium xerosis ГИСК N 181.

Результат враховують через 18-24 год інкубації в термостаті при 37 ^{o C,} тобто через дві доби від початку дослідження. Після закінчення терміну інкубації визначають антіінтерфероновую активність в посіві фекалій, по росту тест-штаму на поверхні і навколо колоній, що свідчить про неблагополуччя в кишковому мікробіоценозе. Виявлення антіінтерфероновой активності у 1-50% виросли колоній свідчить про кишкову дисбиозе; наявність ознаки у понад 50% колоній вказує на кишкову інфекцію, а відсутність ознаки на еубіоз.

На підставі результатів обстеження дітей і дорослих по пошуковій програмі підозра на кишковий дисбіоз або кишкову інфекцію за кількістю антіінтерферонактівних колоній можна вважати підтвердженим. Основна програма, що застосовується на другому етапі діагностичного пошуку як доповнення до пошукової, вимагає розгорнутого бактеріологічного дослідження фекалій з метою уточнення виду та міри дисбіозу кишечника, виду (ешеріхиоз, клебсиеллеза і ін.) Кишкової інфекції та вирішення питання про методи їх корекції.

Теоретичною передумовою до розробки запропонованого способу виявлення кишкового дисбіозу і кишкової інфекції стали виявлені нами відмінності в кількості антіінтерферонактівних колоній на чашках з посівами фекалій у здорових і хворих з кишковими розладами (табл. 1).

Так, при посіві фекалій від 30 хворих з кишковою інфекцією, викликаної ЕПКП 0,18, нетіпіруемие ешеріхіями, клебсиеллой, протеєм та іншими ентеробактеріями, в 28 випадках (93,3%) виявлені антіінтерферонактівние колонії. Для хворих цієї групи виявилося характерним наявність антіінтерфероновой активності у більшості (80-100%) виросли колоній.

При посіві іспаражненій від 100 хворих кишкових дисбиозом позитивні результати антіінтерферонового тесту були виявлені з такою ж частотою (87% хворих), як і при кишкових інфекціях. Однак, на частку антіінтерфероактівних доводилося від 1 до 50% колоній, тобто менше половини виросли на чашці.

При обстеженні 30 клінічно і бактеріологічно здорових дітей і дорослих в 27 випадках (90%) в посіві фекалій не було виявлено колоній, инактивирующих інтерферон. Лише у 3 з 30 обстежених виявлено позитивний антіінтерфероновий тест, при цьому кількість активних колоній становило 3-5% від числа виросли.

Використовуючи описаний вище метод, було проведено скринінгове дослідження 140 дітей дитячого соматичного стаціонару СМЧ ПО "Стріла" м Оренбурга з приводу затяжного кишкової дисфункції. Результати дослідження наведені в табл. 2.

При використанні критеріїв заявленого способу (наявність антіінтерфероновой активності у 1-50% колоній) позитивний результат скринінгу на кишковий дисбіоз виявлено в 22 випадках з 180 (12,2%), в той час як способом-прототипом (виявлення тканинного білка в калі при відсутності біфідобактерій) у 10 випадках (5,6%), P <0,05.

У групі дітей з дисбіозом кишечника позитивні результати скринінгу були підтверджені розгорнутим бактеріологічним дослідженням фекалій за методикою Р.В. Епштейн-Литвак і Ф.Л. Вільшанської (1977).

У хворих з позитивним скринінг-тестом на кишкову інфекцію діагноз був підтверджений бактеріологічним методом (виявлення УПЕ в чистій культурі з розведення фекалій 10 ^-5, що відповідає їх кількості понад 10 ⁶ КУО в 1 г), а й позитивним імунною відповіддю макроорганізму - наявністю сироваткових антитіл до УПЕ в титрі 1: 160 і вище.

Спосіб був використаний для обстеження трьох груп дітей: перша - хворі з кишковим дисбіозом; друга хворі з кишковими інфекціями; третя контрольна. Наводимо конкретні приклади.

Перша група дітей (хворі з дісбізом кишечника).

Приклад 1. Хвора З. 10 років. Діагноз при надходженні хронічний пієлонефрит ешеріхіозной етіології в стадії загострення. При проведенні скринінгу за пропонованим способом виявлений кишковий дисбіоз (кількість антіінтерферонактівних колоній при посіві фекалій склало 15%), в той час як паралельно проведене дослідження калу по прототипу дисбиотических явищ не виявило. В ході подальшого загальноприйнятим методом підтверджено порушення кишкового мікробіоценозу у вигляді збільшення загальної кількості кишкової палички (4,6 Ч 10 ⁹ КУО / г) c появою гемолитических і лактозонегативних форм (відповідно 8 і 20%), а й зниження біфідофлори (10 ⁷ КУО / г). Проведена цілеспрямована корекція мікрофлори кишечника біопрепаратами. Отже, у хворого пропонованим методом виявлено дисбіоз кишечника на ранньому етапі обстеження, що дозволило своєчасно провести корекцію виниклих порушень і зменшити число рецидивів пієлонефриту.

Приклад 2. Хворий Р. 8 років. Страждає екземою з трирічного віку. При бактеріологічному дослідженні фекалій пропонованим методом виявлено 30% колоній, инактивирующих інтерферон. Характер виявлених дисбіотичних порушень встановлено в подальшому шляхом розгорнутого аналізу у вигляді дефіциту біфідобактерій (10 ⁵ КУО / г) і ешерихій (10 ⁶ КУО / г), збільшення вмісту УПЕ клебсієл (10 ⁷ КУО / г).

Друга група хворих (хворі з кишковими інфекціями).

Приклад 1. Хворий М. 2 міс. З анамнезу відомо, що дитина прикладена до грудей на третю добу після народження (післяпологова кровотеча у матері). Після виписки з пологового будинку стілець прискорений до 8-10 раз зі слизом. Вигодовування природне. Відстає в масі (надбавка за 1 місяць 850 г, за другий 300 г). При огляді виявлено ознаки гіпотрофії 1 ступеня. Стілець 2-3 рази на день, рідкий, без патологічних домішок. Антибіотиками нелікувався. При дослідженні фекалій за пропонованим способом, проведеним під час вступу, виявлена ​​антіінтерфероновая активність у 100% колоній в посіві фекалій на живильному агарі з лейкоцитарним інтерфероном, що свідчить про кишкову інфекцію. При подальшому клінічному розробляється і затверджується обстеженні підтверджено наявність ешеріхіозной кишкової інфекції: виявлено ентерпатогенная кишкова паличка серогрупи 018 в кількості 6,3 Ч 10 ⁹ КУО / г зі слабо вираженими ферментативними властивостями. Цілеспрямована антибіотикотерапія в комплексі з патогенетичними засобами привела до позитивного ефекту.

Приклад 2. Хворий Г. 7 років. Скарги на субфебрилітет, рідкий стілець протягом двох днів після вживання сухофруктів. В ході клініко-лабораторного обстеження за пропонованим способом через дві доби після надходження встановлена ​​кишкова інфекція, що обгрунтовано наявністю в посіві фекалій у 80% колоній здатності інактивувати інтерферон. Наступні обстеження виявило нетіпіруемие ешерихії в кількості 2,1 Ч 10 ⁹ КУО / г, гемолітична неактивні, і чотириразове наростання титру антитіл до аутоштамму кишкової палички на другому тижні захворювання.

Третя група дітей (контрольна).

Приклад 1. Дитина А. 5 років. Діагноз при надходженні енурез. При проведенні скринінгу на неблагополуччя в кишкової мікробіоценозе отримано негативний результат антіінтерферонактівних колоній в посіві фекалій не виявлено. Еубіоз підтверджений розгорнутим бактеріологічним аналізом.

Приклад 2. Хлопчик О. 6 років. У віці 5 років оперований з приводу стенозу прілоханочного відділу сечоводу. Післяопераційний період ускладнився синьогнійної інфекцією сечових шляхів. У пошуках джерела інфікування сечового тракту проведено дослідження фекалій за пропонованим способом. Отримано негативний результат. При бактеріологічному дослідженні фекалій підтверджений еубіоз. Інфікування сечових шляхів синьогнійної палички стало наслідком внутрішньо лікарняного інфікування. Застосування синьогнійної фага призвело до санації сечових шляхів.

Таким чином, проведені мікробіологічні дослідження і клінічні випробування показали, що пропонований спосіб володіє наступними перевагами: простий у випробуванні, доступний, неінвазивний, не вимагає спеціальних засобів і устаткування, в порівнянні з прототипом підвищує точність діагностики вдвічі, на одну добу скорочує терміни дослідження. Можливість проведення повторних, навіть щоденних аналізів і є перевагою способу.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

Спосіб виявлення кишкового дисбіозу і кишкової інфекції шляхом посіву досліджуваного матеріалу на живильне середовище, що відрізняється тим, що визначають антіінтерфероновую активність одномоментно у всіх колоній ентеробактерій в посіві фекалій на живильному агарі з препаратом людського лейкоцитарного інтерферону в концентрації 2 МБК для тест-культури Corynebacterium xerosis ГИСК N 181 і при інактивації інтерферону колоніями роблять висновок про стан кишкового мікробіоценозу: відсутність антіінтерфероновой активності у вирослих колоній свідчать про еубіоза; виявлення ознаки у 1 50% колоній вказує на кишкової дисбиоз, а наявність ознаки у понад 50% колоній на кишкову інфекцію.

Версія для друку
Дата публікації 30.03.2007гг

НОВІ СТАТТІ ТА ПУБЛІКАЦІЇ
	Технологія виготовлення універсальних муфт для бесварочного, безрезьбовиє, бесфлянцевого з'єднання відрізків труб в трубопроводах високого тиску (мається відео)
	Технологія очищення нафти і нафтопродуктів
	Про можливість переміщення замкнутої механічної системи за рахунок внутрішніх сил
	Світіння рідини в тонких діелектричних каналох
	Взаємозв'язок між квантової і класичної механікою
	Міліметрові хвилі в медицині. Новий погляд. ММВ терапія
	магнітний двигун
	Джерело тепла на базі нососних агрегатів