початок розділу Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві	хитрощі майстру електроніка фізика технології винаходи	таємниці космосу таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу
Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання)

ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2019186

СПОСІБ ингибицией ВІЛ-інфекції

Ім'я винахідника: Биковський А.Ф .; Міллер Г.Г .; Покідишева Л.М .; Титова І.В .; Артюков О.О .; Попов А.М .; Прозоровський С.В .; Лоенко Ю.М .; Хесс Джозеф [US]; Еляков Г.Б .; Стонік В.А .; Ісаков В.В.
Ім'я патентовласника: Науково-дослідний інститут епідеміології та мікробіології ім.Н.Ф.Гамалеі; Тихоокеанський інститут біоорганічної хімії
Адреса для листування:
Дата початку дії патенту: 1991.02.28

Використання: в медицині, а саме для профілактики і лікування СНІДу та СНІД-асоційованих захворювань. Сутність: в способі використовують низькомолекулярний сульфатованих полісахарид з мовляв. в. менше 20000 Дальтон з фукоза, Сульфатовані по 4-му положенню, залишки якої пов'язані Глікозидний зв'язками, і корелюють з уроновая кислотами при співвідношенні 1: 4 (SO ₃ -FUC, UA = COOH), при цьому вихідний продукт отримують на водорості ламінарія японська. Позитивний ефект: сульфатованих полісахарид низького мовляв. в. не проявляє будь-якої токсичності для клітин ін вітро в дозах понад 5000 мкг / мг.

ОПИС ВИНАХОДИ

Винахід відноситься до медицини, а саме для профілактики і лікування СНІДу та СНІД-асоційованих захворювань.

Відомий спосіб ингибиции ВІЛ-інфекції за допомогою фукоїдан.

Недоліком відомого способу є те, що фукоїдан володіє токсичністю.

Метою винаходу є зниження токсичності.

Дана мета досягається використанням низькомолекулярного Сульфатовані полісахариду (НСП) з мол.в. близько 15000 Дальтон, що містить фукоза, Сульфатовані по 4-му положенню, залишки якої пов'язані Глікозидний зв'язками і корелюють з уроновая кислотами при співвідношенні 1: 4 (SO ₃ -FUC; UA-COOH), при цьому вихідний продукт отримують з водорості ламінарія японська ( Laminaria japonica).

НСП має наступні характеристики.

Фізична характеристика полісахариду. Матеріал і методи.

Хроматографічний аналіз був проведений на скляній колонці з гідрофобним сорбентом Поліхром-1 і з сефакрілом S-300 (фармація, Швеція) з використанням детектора 1КВ UV-VIS (при 254 нм з 2 мл препаративної проточною клітини). Карбогідрати визначали фенольно-сірчанокислим методом.

Для аналізу моносахаридів використовували рідинну газову хроматографію на хроматографе Світло-2 зі скляною колонкою 2,5 х 0,4 см (3% OV-225 на хроматрона N-HMDS) при 150-230 ^о, 5 ^об / хв.

Зразки для аналізу готували гідролізом полисахаридного препарату при 90 ^о С протягом 2 год з 2N HCl з наступним отриманням перацетата альгітола звичайним способом.

Спектр ядерного магнітного резонансу (Н і ¹³ С ЯМР) визначали на спектрометрі Bryker WM-250. Хімічні зсуви реєстрували в ppm від тетраметілксілана.

Результати.

НСП (МВ близько 15000 Дальтон), білий аморфний порошок; [ ] _27,8²⁵ = ¹³ C ЯМР (Д _20); 102,4; 101,2; 100,7; 99,1 ppm (C-1) ¹³ C ЯМР (Д ₂ О); альгінат: 102,4; 101,2; 100,7 (С-1) 71,2; 71,8; 66,0 (С-2) 72,6; 72,8; 70,5 (С-3) 79,2; 801,1 (С-4) 772; 682 (С-5) 176,1; 175,8; 175,6 (С-6) фукоїдан: 99,1 (С-1) 74,9 (С-2) 67,9 (С-3) 81,3 (С-4) 67,9 (С-5) 17,2; 16,6 (С-6).

¹³ С - ЯМР спектр визначали на спектрометрі WM-250 (Bryker).

Таким чином, показано, що полисахаридная фракція є низькомолекулярним компонентом з фукоза, Сульфатовані по 4-му положенню і її залишки пов'язані -1,2-Глікозидний зв'язками і корелюють з уроновая кислотами (маннуровой і гулуроновой) в співвідношенні 1: 4 (SO3-FUC: UA-COOH).

Біологічна характеристика полісахариду.

П р и м і р 1. Інгібуюча активність НСП проти адсорбції ВІЛ-1 і цитопатичної дії вірусу визначалася на клітинах МТ4 наступним чином:

a) Прямий вируснейтрализующие ефект

1 мл суспензії ВІЛ-1, отриманої після високошвидкісного центрифугування віруссодержащей культуральної рідини з клітин Н9 / ШВ або НТН1У ₂₇ і 1 мл розчину НСП у відповідних концентраціях (0,1 до 100 мкг / мл) поміщали в пробірки і залишали для контакту на 2 ч при 37 ^о С або кімнатній температурі. Після цього рівні кількості клітин МТ4 предобработанних полібреном були додані в кожну пробірку для адсорбції вірусу з множинністю інфекції (МІ), що дорівнює 100, і залишали для контакту при 37 ^о С на 1-1,5 ч.

Після контакту клітини осаджували низькошвидкісним центрифугуванням протягом 10 хв, супернатант видаляли, клітини ресуспендіровалі в середовищі РРМ1 1640 з 10% фетальної телячої сироватки до кінцевої концентрації 2 х 10 ⁵ кл / мл. Клітинну суспензію в кількості 1 мл розподіляли в 24-ямкові плато і культивували при 37 ^о С і 5% _СО2 протягом 7 днів.

б) Інгібуючий ефект НСП на адсорбцію ВІЛ-1 на клітинах МТ4.

За 2х10 ⁵ кл / мл МТ4 розподіляли в кожну лунку 24-ямковий плато і після короткого періоду осідання клітин на дні лунок вносили відповідні концентрації НСП і преінкубіровалі при 37 ^о С протягом 1 год, після чого вносили вірусну суспензію з МІ-100 і культивували клітини при тих же умовах 7 діб. Відсоток клітин, експресуватися і неекспрессіровавшіх вірусний антиген на поверхневій мембрані обчислювали як середнє арифметичне трьох повторностей від кожних 100 клітин в методі непрямої імунофлуоресценції.

Співвідношення Х адсорбції-ингибиции вірусу, залежне від концентрації НСП визначали за такою формулою,%:

де a - антиген позитивних клітин в препаратах, оброблених НСП,%;

b - антиген позитивних клітин в необроблених препаратах,%

100 - антиген позитивних клітин в контрольних препаратах (див. Табл. 1 і 2).

Антикоагуляційний ефект НСП був більш ніж в 10 разів нижче, ніж у гепарину. Якщо 50% значення для анти-ВІЛ активності на клітинах МТ4 (див. Табл. 1 і 2) перевести з мкг / мл в од / мл, отримаємо наступні значення, од / мл: НСП 6,7х10 ^-3; фукоїдан 3,6х10 ^-3; гепарин 1 х 10-3.

Таким чином, НСП володіє анти-ВІЛ активність при концентраціях більше ніж в 100 разів низьких, ніж його антикоагуляційної активність.

Визначення ін віво і ін вітро гострої токсичності полисахаридной фракції НСП.

Визначення гострої токсичності ін віво проводили на білих мишах (по 10 тварин в кожній групі), 4-5 тижневого віку, масою 21-24 м НСП, розведений в фізіологічному розчині в відповідних концентраціях, вводили тваринам трьома різними шляхами: внутрішньовенно, внутрішньоперитонеально, перорально. Провідні симптоми, загибель і масу тіла досліджували у кожної тварини протягом 7-денного періоду спостереження, після чого кожна тварина забивали і піддавали анатомічному дослідженню внутрішні органи. Як показано в табл. 3, ні в однієї тварини, яка отримувала препарат одним із зазначених способів, не було виявлено ніяких симптомів гострої токсичності або будь-яких порушень морфології внутрішніх органів (див. Табл. 4).

Цитотоксичність НСП ін вітро на клітинах МТ4 і Н9 проявлялась навіть при концентраціях препарату вище 5000 мкг / мл в порівнянні з прототипна фукоіданом, для якого 50% цитотоксическая доза, що визначається за виживання клітин MT4, дорівнює 1060 ± 210 мкг / мл або з азидотимидином ( Сигма), який токсичний для клітин при концентраціях понад 1000 мкг / мл.

Таким чином, НСП може бути використаний як у вигляді самостійної формули, так і в якості складового компонента фармацевтичної композиції або в комбінації з іншими відомими препаратами, такими як АЗТ.

Інгібуючий ефект НСП на назад транскріптазная активність ін вітро визначали з використанням вірусу пташиного міелобластоза (АМВ) в якості джерела ензиму (надано НДІ молекулярної біології і генетики АН СРСР, Київ). Тестування проводили за відомим методом. 2 мг НСП розчиняли в 1 мл стерильної дистильованої води і доводили до відповідних концентрацій. 20 мл обсяг реакційної суміші складався з:

50 мМ Тріс-HCl, pH 8,2; 5 М MgCl _2; 1 g олиго (d АТР) РНК, рН 8,2 в якості матриці, 20 М dАТР, dСТР, dТТР і 0,5 Ki ³ H-dСТР; 60 М KCl, 1 М -меркаптоетанола і поміщали в 1,5 мл пробірки Еппендорф, які поміщали у водяну баню при 37 ^о С на 5 хв. Після цього 20 мкл раніше приготовленого розчину НСП відповідних концентрацій додавали в реакційну суміш разом з 1 мкл зворотної транскриптази АМВ і залишали для взаємодії при 37 ^о С на 1 ч. Після цього реакційну суміш переносили на мембранні фільтри ДЕ-81, промивали 5 разів з 5 -хвилинний перервою при струшуванні, висушували і поміщали в скляні контейнери, що містять по 10 мл рідкого сцинтиляційного коктейлю. Радіоактивність (с.р.м.) кожного фільтра підраховували за 1 хв в сцінцілляціонном лічильнику. Рівень ингибиции назад транскриптазної активності (ІТА) підраховували за формулою

ІТА = x 100,%, де С _о - контрольна радіоактивність зразка без НСП;

_C s - радіоактивність зразка після преінкубаціі з НСП.

Рівень ингибиции ВІД активності показаний на кресленні.

Таким чином, сульфатованих полісахарид низького мол.в. не проявляє будь-якої токсичності для клітин ін вітро в дозах понад 5000 мкг / мл і лабораторних тварин ін віво і може бути отриманий за допомогою дешевої безвідходної технології шляхом обробки морської водорості (Laminaria japonica).

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

СПОСІБ ингибицией ВІЛ-інфекції шляхом застосування Сульфатовані полісахариду, який відрізняється тим, що, з метою зниження токсичності, використовують низькомолекулярний сульфатованих полісахарид з мол.м. менше 20000 Дальтон, з фукоза, Сульфатовані по 4-му положенню, залишки якої пов'язані Глікозидний зв'язками і корелюють з уронові кислоти при співвідношенні 1: 4 (SO ₃ - FUC; UA - COOH), при цьому вихідний продукт отримують з водорості Ламінарія японська ( Laminaria japonica).

Версія для друку
Дата публікації 06.01.2007гг

НОВІ СТАТТІ ТА ПУБЛІКАЦІЇ
	Технологія виготовлення універсальних муфт для бесварочного, безрезьбовиє, бесфлянцевого з'єднання відрізків труб в трубопроводах високого тиску (мається відео)
	Технологія очищення нафти і нафтопродуктів
	Про можливість переміщення замкнутої механічної системи за рахунок внутрішніх сил
	Світіння рідини в тонких діелектричних каналох
	Взаємозв'язок між квантової і класичної механікою
	Міліметрові хвилі в медицині. Новий погляд. ММВ терапія
	магнітний двигун
	Джерело тепла на базі нососних агрегатів