| початок розділу
Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві |
хитрощі майстру
електроніка фізика технології винаходи |
таємниці космосу
таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу |
  |
| Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання) | |||
Навігація: => |
На головну / Каталог патентів / В розділ каталогу / Назад / |
|
ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2251701
СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ стадій ВІЛ-інфекції
Ім'я винахідника: Сізякіна Людмила Петрівна (RU); Андрєєва Ірина Іванівна (RU)
Ім'я патентовласника: Сізякіна Людмила Петрівна (RU); Андрєєва Ірина Іванівна (RU)
Адреса для листування: 344022, Ростов-на-Дону, пров. Нахічеванський, 29, Ростовський державний медичний університет, патентний відділ
Дата початку дії патенту: 2004.06.07
Винахід відноситься до галузі клінічної імунології та може бути використано для визначення стадій ВІЛ-інфекції. Суть винаходу полягає в тому, що методом імуноферментного аналізу тестують сироватку крові, визначають оптичну щільність - ОП вихідного зразка сироватки і оптичну щільність вихідного зразка сироватки, інкубувати протягом 10 хвилин з 100 мкл 3,5 М розчину ізотіоціоната натрію - NaSCN і при зниженні ОП на 40% і менше діагностують стадію а - генералізованої лімфаденопатії, при зниженні ОП в інтервалі 40-60% діагностують стадію в - пре-СНІД, а при зниженні ОП на 60% і більше діагностують стадію С - СНІД.
ОПИС ВИНАХОДИ
Винахід відноситься до галузі медицини, переважно клінічної імунології, а саме до іммунодіагностікі інфекції, викликаної вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), та може знайти застосування при визначенні стадій ВІЛ-інфекції.
ВІЛ-інфекція продовжує залишатися однією з найактуальніших проблем сучасної медицини. З 1990 року реєструється пандемія, що означає поширення цієї хвороби по всій планеті, при цьому в Росії за останні 3 роки зареєстровано понад 200 тисяч ВІЛ-інфікованих. Поширюючись на "нові" території, хвороба не йде із захоплених раніше. Крім того, біологія ВІЛ-інфекції така, що відсутні природні механізми протистояння, і тільки соціальні чинники здатні протидіяти подальшої прогресії пандемії (PMХаітов, Г.А.Ігнатьева, І.Г.Сідоровіч. Імунологія - М .: Медицина, 2000. - З .291-295).
До реально ефективних засобів боротьби з поширенням ВІЛ слід віднести своєчасну і якісну діагностику, значимість якої простежується з двох позицій. По-перше, виявлення факту інфікування дозволяє використовувати дієві способи профілактики подальшого поширення інфекції. По-друге, рання діагностика при інфікуванні ВІЛ сприяє своєчасному призначенню досить ефективних терапевтичних заходів, які пролонгують початкові стадії ВІЛ-інфекції і таким чином суттєво впливають на її прогресію. У зв'язку з цим досить актуальною продовжує залишатися проблема вибору надійних критеріїв, що дозволяють швидко, достовірно, своєчасно і з найменшими матеріальними витратами визначити стадії інфекційного процесу, викликаного ВІЛ (Л.П.Сізякіна, В.Н.Чернишев - ВІЛ-інфекція у дітей. - Ростов-на-Дону, - 2001. - С.81).
В даний час ВООЗ прийнята класифікація стадій інфекційного процесу, опосередкованого ВІЛ, заснована на клінічних проявах, відповідно до яких визначають початкову або стадію А - генералізованої лімфаденопатії (ГЛАП), для якої характерно не тільки відсутність патогномонічних ознак, але і клінічно стабільний стан пацієнта. Стадія В (пре-СНІД) характеризується наростанням різноманітної клінічно значущої симптоматики - бацилярний ангиоматоз, орофарінгіальний кандидоз, цервікальна карцинома, общеінфекціонние синдроми, такі як лихоманка або діарея більше місяця, лейкоплакія язика, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, периферична нейропатія. Для стадії С - СНІД (термінальної) характерними клінічними ознаками є легеневий туберкульоз, рецидивна пневмонія, пухлини різноманітної локалізації (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Визначення стадій інфекційного процесу необхідно для обгрунтування варіанта своєчасної адекватної терапії, що дозволяє подовжити середні терміни життя інфікованих ВІЛ і для профілактики поширення інфекції. Проведений аналіз патентної та науково-медичної літератури виявив ряд способів діагностики стадій ВІЛ-інфекції.
Зокрема, тестом, використовуваним при визначенні стадій ВІЛ-інфекції та є підставою для призначення противірусної терапії є оцінка вірусного навантаження периферичної крові за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Кравченко А.В., Серебровська Л.В., Голохвостова Е.Л. та ін. Тімазід в поєднанні з хівідом і інвіразой в комплесной терапії хворих з ВІЛ-іфекціей. - Епідеміологія та інфекційні хвороби. - 1998. - №5 - с.51-52). Суть методу полягає в кількісному визначенні копій РНК вірусу в плазмі. Однак слід зазначити відсутність чіткої кореляції між прогресією інфекційного процесу і вірусним навантаженням плазми. Зокрема, стадії А ВІЛ-інфекції відповідає високий рівень вмісту вірусу в плазмі. Наступна стадія - В (пре-СНІД) характеризується істотним зниженням числа копій РНК вірусу, незважаючи на клінічну прогресію інфекції. В термінальній стадії С (СНІД) знову реєструється необмежена прогресія рівня РНК ВІЛ в крові (В.В.Шкарін, С.Н.Сорінсон. ВІЛ / СНІД - інфекція. Двадцять років по тому після початку пандемії. - Н.-Новгород: Изд у НГМА, 1999. - С.43). Таким чином, даний тест недостатньо інформативний для характеристики рівня імунодефіциту, що розвивається. До недоліків методу слід віднести і його високі технологічну складність і вартість, а саме: необхідність суворого дотримання особливих умов - стерильності і температурного режиму при заборі крові, її транспортуванні та проведенні тесту. При цьому крім сертифікованих діагностичних наборів необхідні не тільки дуже дорогі прилади, але і комплекс лабораторних кімнат, в тому числі стерильних боксів. Безпосередня методика визначення геному вірусу досить трудомістка і тривала, займає не менше 5 годин.
Спосіб лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції (патент №2123187 опублікований в БІ №34) передбачає іонообмінних хромотограф сироватки з подальшим ІФА визначенням рівня "прихованих" антитіл. Даний метод, який має значення в прогнозі перебігу ВІЛ-інфекції, не орієнтований на визначення її стадій.
Спосіб визначення антитіл до вірусу імунодефіциту людини (пат. №2032907 опублікований в БІ №10) може бути використаний при встановленні факту інфікування ВІЛ, але не пов'язаний з визначенням стадії інфекції.
Спосіб твердофазного імуноферментного визначення антитіл до вірусу імунодефіциту людини (пат. 4653296 / 30-13, БІ №45) має на меті підвищення чутливості способу визначення антитіл до ВІЛ, але й не може бути використаний для діагностики стадії інфекційного процесу.
Відомий спосіб оцінки стадій ВІЛ-інфекції (Клінічна імунологія та алергологія під ред. Г.Лолора-молодшого. - М., Практика, 2000. - С. 585-587), що полягає у визначенні рівня сироваткового 
2-мікроглобуліну. Збільшення концентрації цього білка, що визначається за допомогою діагностичних наборів імуноферментного аналізу, відповідає прогресії ВІЛ-інфекції. Тим часом, дані зміни неспецифічні, оскільки подібна динаміка 2-мікроглобуліну можлива не тільки при ВІЛ-інфекції, але і при пухлинних процесах, цирозі печінки, лімфопроліферативних захворюваннях. Таким чином, цей метод недостатньо інформативний для оцінки стадій ВІЛ-інфекції через свою відсутності адресності (А.Ройт, Дж. Брістофф Імунологія. - М .: Світ, 2000. - с.411).
Найбільш близьким технічним рішенням, прийнятим нами за прототип, є спосіб діагностики стадій ВІЛ-інфекції (В.В.Покровскій з співавт. "Клінічна діагностика і лікування ВІЛ-інфекції". - М .: ГОУ ВУНМЦ РФ, 2001. - С.11 ), що полягає у визначенні абсолютної кількості CD4 + лімфоцитів периферичної крові. Дана методика складається з ряду послідовних етапів: виділення популяції лімфоцитів за допомогою нашарування 2 мілілітрів крові на заздалегідь приготовлений розчин фіколла і верографина з градієнтом щільності 1,077 г / см 3, центрифугування отриманої суміші на центрифузі ОПН-3 при швидкості 1 тис. Обертів на хвилину протягом 35 хвилин, видалення в окрему пробірку утворився "лимфоцитарного кільця" з подальшою триразовою "відмиванням" від суміші фіколл - верографін центрифугуванням в культуральному середовищі 199 при 1,5 тис. обертів на хвилину протягом 5 хвилин. Далі до відмитої суспензії лімфоцитів додають моноклональні антитіла до CD4 поверхневого антигену, мічені флюорохромом, отриману суспензію інкубують протягом 40 хвилин при 4 ° С, після чого знову відмивають на центрифузі ОПН-3 в середовищі 199 протягом 5 хвилин при 1,5 тисячах обертів в хвилину. Після цього проводять визначення відносної кількості CD4 позитивних лімфоцитів на проточної цитофлюориметрії. Саме цей прилад дає можливість найбільш адекватної оцінки рівня CD4 + клітин. У той же день визначають формулу крові пацієнта, після чого розраховують абсолютну кількість CD4 + ліфoцітoв за формулою: кількість лейкоцитів × 10 9 л ×% лімфоцитів ×% CD4 + лімфоцитів: 10000. При цьому, якщо абсолютне число CD4 + Т-клітин більше 0,5 × '10 9 / л, діагностують стадію А; при абсолютній кількості CD4 + ліфoцітoв в межах 0,2-0,499 × '10 9 / л - стадію В; при абсолютному числі CD4 + лімфоцитів менше 0,2 клітин × '10 9 / л діагностують стадію С - (CDC MMWR, 1992, v.41, N RR - 17, р.22). Недолік способу - складність його реалізації. Зокрема, результати даного тесту можуть бути об'єктивними лише при використанні високоспецифічних сертифікованих реактивів (моноклональних антитіл) і вкрай дорогого приладу - проточного цитофлюориметрів, що вимагає допоміжного обслуговуючого персоналу - інженерів, програмістів. Ці діагностичні прилади знаходяться лише в спеціалізованих центрах регіонального масштабу, що значно ускладнює можливість оцінки стадій ВІЛ-інфекції. В першу чергу через те, що аналіз заснований на характеристиці рецепторів життєздатних клітин крові, тому дослідження обмежена часовими рамками - інтервал між забором крові і її тестуванням не повинен перевищувати 3-4 годин. Методику ускладнюють і додаткові аналізи - визначення формули крові та загального числа лейкоцитів з метою підрахунку основного критерію - абсолютного числа CD4 + лімфоцитів периферичної крові. Для прототипу характерна недостатня інформативність через лабільності показників, не пов'язаної безпосередньо з фактом інфікування ВІЛ. Зміни числа CD4 + лімфоцитів вельми неспецифічні і можуть спостерігатися при інших захворюваннях. У зв'язку з цим діагностична значимість тесту може бути важлива лише в контексті з іншими критеріями ВІЛ-інфекції.
Метою даного винаходу є спрощення способу діагностики стадій ВІЛ-інфекції.
Ця мета досягається шляхом дослідження сироватки крові пацієнта, яку ділять на 2 порції. На основі імуноферментного аналізу визначають оптичну густину (ОГ) вихідного зразка сироватки, яка відображатиме рівень специфічних анти-ВІЛ антитіл у пацієнта і ОП другої порції, інкубували протягом 10 хв зі 100 мкл 3,5 М розчину ізотіоціоната натрію і характеризує рівень анти-ВІЛ- імуноглобулінів, що не зруйнували зв'язок з антигенами ІФА-планшета в умовах інкубації з NaSCN. На підставі отриманих результатів по% зниження значень ОГ вихідної сироватки визначають стадію ВІЛ-інфекції: при зниженні ОП на 40% і менше діагностують стадію А - генералізованої лімфаденопатії, при зниженні оптичної щільності у відкритому інтервалі 40-60% діагностують стадію В - пре-СНІД , а при зниженні ОП на 60% і більше діагностують стадію С - СНІД.
Пропонований спосіб здійснюється наступним чином: у пацієнта проводять забір венозної крові в кількості 2-3 мілілітрів, після чого її центрифугують при 3 тис. Обертів на хвилину протягом 10 хвилин на центрифузі ОПН-3, відокремлюють сироватку крові, ділять її на 2 порції. Зразок сироватки додають в лунку діагностичної ІФА тест-системи з сорбованих антигенами ВІЛ (відповідно до наказу МОЗ і МП РФ №170 від 16.08.94). Потім відмивають розчин з метою видалення компонентів сироватки, що не зв'язалися з ВІЛ-антигенами. Далі в лунку додають антитіла до імуноглобулінів людини, кон'юговані з ферментом, що змінює забарвлення послідовно доданого хімічного реагенту - субстрату. При цьому в разі наявності в тестованої сироватці анти-ВІЛ-антитіл вміст лунки змінює колір. З використанням спеціального приладу - імуноферментного автоматичного аналізатора визначають оптичну щільність вмісту лунки, яка відображатиме рівень специфічних антитіл до ВІЛ у зразку.
Одночасно в другу лунку діагностичного планшета крім тестованої сироватки додають 100 мкл 3,5 М розчину ізотіоціоната натрію (NaSCN), отриманий розчин інкубують протягом 10 хв. Далі дотримується послідовність етапів, описана вище: відмивають розчин з метою видалення компонентів сироватки, що не зв'язалися з ВІЛ-антигенами, в лунку додають антитіла до імуноглобулінів людини, кон'юговані з ферментом, що змінює забарвлення послідовно доданого хімічного реагенту - субстрату, при наявності в тестованої сироватці анти -ВІЧ-антитіл вміст лунки змінює колір. З використанням імуноферментного автоматичного аналізатора визначають оптичну щільність вмісту лунки, яка відображатиме рівень специфічних антитіл до ВІЛ після обробки 3,5 М розчином ізотіоціоната натрію (NaSCN).
Далі обчислюють% зміни ОП по відношенню до вихідного зразка сироватки і при зниженні значень ОГ на 40% і менше діагностують стадію А - генералізованої лімфаденопатії, при зниженні ОП у відкритому інтервалі 40-60% діагностують стадію В - пре-СНІД, а при зниженні ОП на 60% і більше діагностують стадію С - СНІД.
Реалізація способу підтверджується наступними клінічними прикладами.
Приклад 1. Пацієнт С., історія хвороби №122 / 198. При проведенні епідеміологічного розслідування було виявлено як контактний з інфікованим ВІЛ. При клінічному огляді ознак патології не виявлено. Скарг не було, стан задовільний. Пацієнту, відповідно до пропонованого способу було проведено дослідження сироватки крові, в результаті якого були отримані наступні результати: ВП вих = 1500, ОП інк = 1200. У зв'язку зі зниженням ОП на 20% діагностовано стадія А ВІЛ-інфекції.
Приклад 2. Пацієнт Д., історія хвороби 68/103. При плановому диспансерному обстеженні була виявлена генералізована лімфаденопатія, гепатосплеіомегалія. Пацієнту відповідно до заявляється способом було проведено дослідження сироватки крові. Значення ОП вих = 1627, ОП інк = 897, зниження значення ОП = 45%, в зв'язку з чим хворому поставлений діагноз: ВІЛ-інфекція, стадія В - пре-СНІД, призначена адекватна терапія.
Приклад 3. Пацієнт Е., історія хвороби 1203/109. Перебував в інфекційному стаціонарі з клінічними проявами пневмоцистної пневмонії і нефропатії. Хворому відповідно до заявляється способом було проведено дослідження сироватки крові. ОП вих = 1020 ОП інк = 340, зниження оптичної щільності = 67%. Хворому відповідно до заявляється способом було поставлено діагноз "СНІД", призначена адекватна терапія.
Приклад 4. Пацієнт С., історія хвороби 101/04. Протягом року перебував на диспансерному обліку в обласному центрі з профілактики та боротьби зі СНІДом, скарг не пред'являв. Відповідно до заявляється способом було проведено дослідження сироватки крові. Значення ОП вих = 1920 році, ОП інк = тисячу сто п'ятьдесят дві, зниження ОП = 40%, в зв'язку з чим поставлений діагноз: ВІЛ-інфекція, стадія А - генералізована лімфаденопатія.
Приклад 5. Пацієнт Ш., історія хвороби 88/98. Виявлено як контактний з інфікцірованнимі ВІЛ внутрішньовенними наркоманами. При клінічному огляді була виявлена пневмонія, встановлений факт зниження маси тіла на 16 кг протягом півроку. Пацієнту відповідно до заявляється способом було проведено дослідження сироватки крові. Значення ОП вих = 1950, ОП інк = 780, зниження значення ОП = 60%. Хворому був поставлений діагноз - ВІЛ-інфекція, стадія С - "СНІД", призначена адекватна терапія.
Відповідно до пропонованого способом оцінки стадій ВІЛ-інфекції нами на базі НУПК "Клінічна імунологія" РостГМУ були протестовані 86 зразків сироваток інфікованих пацієнтів. З них 44 поставлено діагноз: ВІЛ-інфекція в стадії А, так як зниження значень ОГ склало 40 і менше%, 32 пацієнтам - діагноз: ВІЛ-інфекція в стадії В - пре-СНІД (ОП знижувалася більш, ніж на 40, але менш , ніж на 60%), а у 10 осіб діагностовано стадія С (СНІД), при цьому% зниження ОП був 60 і більше.
Нами було проведено аналіз 42 історій хвороби осіб, які перебувають на стаціонарному лікуванні в спеціалізованому відділенні ВІЛ-інфекції ГБ-1 м Ростова-на-Дону, З них у 20 осіб був діагноз "ВІЛ-інфекція в стадії А (ГЛАП)", у 16 - "ВІЛ-інфекція в стадії в (пре-СНІД)", а у 6 - "СНІД". Цим пацієнтам нами були проведені дослідження згідно заявляється способу. Отримані результати показали, що у 3 осіб з 20 діагноз "ВІЛ-інфекція в стадії А" був поставлений помилково, нами у даних пацієнтів була діагностована стадія В - пре-СНІД (ОП знижувалася більш, ніж на 40, але менше, ніж на 60 %), що надалі підтвердилося клінічними ознаками, 4 пацієнтам з 16 з діагнозом стадія в (пре-СНІД) нами на основі заявляється способу діагностики стадій ВІЛ-інфекції був визначений діагноз "СНІД", так як% зниження ОП = 60 і більше. Це дозволило своєчасно відкоригувати терапію. У 100% випадків термінальної стадії ВІЛ-інфекції С (СНІД) діагнози збігалися (у всіх пацієнтів зниження ОП було рівним або перевищувало 60%). При цьому для діагностики стадій ВІЛ-інфекції відповідно до заявляється способом не вимагалося використання додаткових трудовитрат, діагностичних наборів і дорогого устаткування.
Таким чином, пропонований спосіб в порівнянні з прототипом більш простий.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб діагностики стадій ВІЛ-інфекції шляхом дослідження крові, який відрізняється тим, що тестують сироватку крові методом імуноферментного аналізу, визначають оптичну щільність - ОП вихідного зразка сироватки і оптичну щільність вихідного зразка сироватки, інкубували протягом 10 хв зі 100 мкл 3,5 М розчину ізотіоціоната натрію - NaSCN і при зниженні ОП на 40% і менше діагностують стадію а - генералізованої лімфаденопатії, при зниженні ОП в інтервалі 40-60% діагностують стадію в - пре-СНІД, а при зниженні ОП на 60% і більше діагностують стадію С - СНІД .
Версія для друку
Дата публікації 06.01.2007гг
Коментарі
Коментуючи, пам'ятайте про те, що зміст і тон Вашого повідомлення можуть зачіпати почуття реальних людей, проявляйте повагу та толерантність до своїх співрозмовників навіть у тому випадку, якщо Ви не поділяєте їхню думку, Ваша поведінка за умов свободи висловлювань та анонімності, наданих інтернетом, змінює не тільки віртуальний, але й реальний світ. Всі коменти приховані з індексу, спам контролюється.