початок розділу Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві	хитрощі майстру електроніка фізика технології винаходи	таємниці космосу таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу
Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання)

ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2208786

СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ СПОНТАННОЇ КЛІТИННОЇ Цитотоксичність

Ім'я винахідника: нішевих Е.С .; Галустян О.М.
Ім'я патентовласника: Державна освітня установа вищої професійної освіти Санкт-Петербурзька державна педіатрична медична академія
Адреса для листування: 194100, Санкт-Петербург, вул. Литовська, 2, Санкт Петербурзька державна педіатрична медична академія, патентна служба, О.В.Железняковой
Дата початку дії патенту: 2001.12.28

Винахід відноситься до медицини і може бути використано в імунології, вірусології, онкології, трансплантології. Спосіб полягає в наступному: з периферичної крові пацієнта виділяють мононуклеари, готують клітини-мішені, в якості яких використовують гладкі клітини щурів, змішують мононуклеари і клітини-мішені в співвідношенні 20-30: 1, центрифугують отриману суміш, інкубують протягом 30 хв, після чого здійснюють облік результатів цитотоксической реакції шляхом підрахунку кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів у відсотках від загальної кількості огрядних клітин щурів в суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів. При значенні цього показника 25-35% визначають нормальну спонтанну клітинну цитотоксичність, при значенні менше 25% визначають знижену спонтанну клітинну цитотоксичність, а при значенні цього показника понад 35% визначають підвищену спонтанну клітинну цитотоксичність. Спосіб дозволяє підвищити точність прогнозу.

ОПИС ВИНАХОДИ

Винахід відноситься до галузі медицини, а саме до імунології, вірусології, онкології, трансплантології, і може бути використано для оцінки імунного статусу здорових і хворих людей; для оцінки рівня противірусною і протипухлинною захисту організму; для прогнозування кризів відторгнення трансплантатів.

Відомі способи визначення спонтанної клітинної цитотоксичності (РКЦ) з використанням в якості клітин-мішеней для цитотоксичних клітин мишей штучно культивованих пухлинних клітин, зокрема клітин мишачих пухлин Р815, EL4, BW5147, мічених радіоактивним ізотопом. Відомі способи-аналоги включають такі операції: виділення мононуклеарів з периферичної крові; приготування клітин-мішеней, включаючи мічення їх радіоактивним ізотопом; змішування мононуклеаров і клітин-мішеней і облік результатів цитотоксической реакції по виходу використовуваного радіонукліда. Як радіоактивних ізотопів використовують ³¹ Сr, ³ [H] -пролін, ¹²⁵ [I] -дезоксіурідін, ³ [H] -урідін і т.п. [1, 2].

Відомі способи-аналоги не забезпечують досягнення технічного результату заявленого способу в зв'язку з наступним. Пухлинні лінії, що застосовуються для визначення СКЦ у мишей, як правило, не використовуються для визначення СКЦ у людини [2]. На думку авторів винаходу, це може бути обумовлено відсутністю специфічних рецепторів на зазначених клітинах-мішенях, внаслідок чого вплив цитотоксичних клітин людини на морфологічні та функціональні властивості цих клітин-мішеней практично не проявляється.

Відомі способи визначення СКЦ з використанням в якості клітин-мішеней для цитотоксичних клітин людини штучно культивованих пухлинних клітин лімфоми миші УАС-1 [3] і мієлоїдної перещеплюваної клітинної лінії К-562 [4].

Найбільш близьким до заявленого рішенням за сукупністю суттєвих ознак є спосіб визначення СКЦ з використанням в якості клітин-мішеней мієлоїдній перещеплюваної клітинної лінії К-562 [4]. Спосіб, прийнятий за прототип, здійснювали наступним чином. У пацієнта з вени брали кров в кількості 6 мл в Пеніцилінові флакони з 0,2 мл 5% ЕДТА і розділяли в градієнті щільності фіколл / верографина (d = 1,077). Отриману суспензію мононуклеарних клітин (мононуклеаров) один раз відмивали в 8 мл фосфатного буфера і два рази - в розчині Хенкса з 5% бичачої сироваткою. Кінцеву концентрацію клітин доводили до 5х10 ⁶ / мл середовища RPMI-1640 з додаванням 10% бичачої сироватки. Приготування клітин-мішеней здійснювали наступним чином. Клітинну лінію К-562 вирощували на культуральному середовищі RPMI-1640 яку збагачували "добавками": 500 мл RPMI-1640 +20 mM глютамина + 20 mM Hepes (Serva) +100 од / мл пеніциліну +10 од / мл стрептоміцину або гентаміцину; як сироваткову добавку використовували інактивовану бичачу сироватку. У стерильний пеніциліновий флакон поміщали 0,6 мл перещеплюваної клітинної суспензії (містить 3х10 ⁵ клітин), 0,6 мл інактивованої бичачої сироватки і 1,8 мл середовища RPMI-1640; флакони інкубували протягом 4 діб при 37 ^o С. На 4-ту добу культивування, коли концентрація клітин досягала 5х10 ⁵ в 1 мл, клітини перевивали в свіжу середу. Клітини 2-го або 3-го дня культивування облягали центрифугуванням при 150g протягом 5 хв, ресуспендіровалі в свіжому середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% бичачої сироватки. 1х10 ⁶ клітин мітили 250 мк Ku ⁵¹ Cr (Na ₂ CrO ₄₎ (92,5xl0 ⁵ Бк) з питомою активністю 2-5 мКи / мМ (7,4-18,5х10 ⁷ Бк) в обсязі 0,5 мл; поміщали в термостат і інкубували протягом 1 год при 37 ^o С. Клітини тричі відмивали в середовищі Хенкса з 5% бичачої сироваткою, Центріфугіруем при 150g протягом 5 хв; кінцеву концентрацію клітин доводили до 1х10 ⁵ в 1 мл середовища RPMI-1640 з 10% бичачої сироваткою. З'єднували клітини-мішені і мононуклеари. При цьому клітини-мішені по 0,1 мл (1х10 ⁴ клітин) розкопували в лунки круглодонной панелі фірми "Cook" з урахуванням необхідної кількості проб і обсягу досвіду. Мононуклеари по 0,1 мл (0,5х10 ⁶ клітин) розкопували так, щоб для кожної проби досліджуваної крові припадав свій ряд лунок; як досвідчені, так і контрольні проби тестували в триплеті; до контрольних проб замість 0,1 мл суспензії мононуклеарів додавали 0,1 мл культурального середовища, співвідношення клітин-мішеней і мононуклеарів в дослідних пробах відповідало 1: 50. На етапі розкопування мішеней по 0,1 мл суспензії клітин заливали в центрифужні пробірки і зберігали до закінчення досвіду; вони служили для визначення максимального включення ⁵¹ Cr (M). Панель поміщали в інкубатор (37 ^o С) з подачею 5% CO ₂ і відносною вологістю 100%, де інкубували 16 год. Після закінчення інкубації з лунок забирали 0,1 мл супернатанту, заміряли активність досвідчених проб разом з контрольними пробами на U -Лічильники .

Облік результатів реакції здійснювали наступним чином. Цитотоксическая активність мононуклеарів (РКЦ) виражалася в% з урахуванням загального включення ⁵¹ Сr і його спонтанного виходу:



де А - подвоєне середнє значення виходу ⁵¹ Сr в трьох досвідчених лунках;

В - то ж, але в контрольних лунках;

С - 80% від загального включення ⁵¹ Сr в 1х10 ⁴ клітин (М) мішеней.

Спонтанний вихід ⁵¹ Сr (В) при такій постановці досвіду в середньому становив 16% від значення С (1% на годину).

При значенні цього показника, що становить в середньому (53,6 ± 3,7)% (рівень цитотоксичної активності у здорових людей), визначали нормальну цитотоксичну активність (РКЦ). При значеннях цього показника, достовірно знижених в порівнянні з нормою, визначали знижену цитотоксичну активність (РКЦ). При значеннях цього показника, достовірно перевищують середні значення цитотоксичної активності у здорових людей, визначали підвищену цитотоксичну активність (РКЦ).

Спосіб-прототип [4] не дозволяє отримати технічний результат, який досягається при використанні заявленого способу, з наступних причин. Відомо, що клітини живого організму, що володіють СКЦ (звані далі в тексті "цитотоксические мононуклеари" або "клітини-ефектори"), належать, головним чином, до нормальних кілерам і мають здатність руйнувати чужорідні клітини, клітини, уражені вірусом, а й пухлинні клітини .

В даний час внаслідок неможливості оцінки цитотоксичних реакцій in vivo визначення СКЦ виробляють шляхом постановки лабораторних реакцій з використанням клітин-мішеней, у нормі не містяться в організмі [2].

Відомо, що застосовуються в способі-прототипі [4] штучно культивовані пухлинні клітини мієлоїдній лінії мають дрібні гранули [5], вихід яких з клітин в ході цитотоксической реакції практично неможливо враховувати за допомогою мікроскопії. Відомо і, що зумовлені впливом цитотоксичних мононуклеаров процеси, результатом яких є значимі морфологічні зміни в клітинах-мішенях, протікають протягом тривалого періоду часу (інкубація від 16 год до 5-ти - 6-ти діб) [2].

Крім того, у пухлинних клітин-мішеней, на думку авторів заявленого рішення, відсутні особливі специфічні високочутливі рецептори до перфоріном та цитокінів, які продукуються клітинами-ефекторами. У зв'язку з цим облік морфологічних змін в пухлинних клітинах принципово можливий тільки шляхом підрахунку загиблих під дією мононуклеаров клітин-мішеней. Однак опису подібного способу визначення СКЦ в переглянутої науково-медичної та патентної літературі автори винаходу не виявили. Це може бути обумовлено тим, що практична реалізація подібного підходу за допомогою стандартних лабораторних прийомів і лабораторного обладнання буде характеризуватися відносно високою суб'єктивністю і відносно низькою точністю визначення (внаслідок можливості масової спонтанної загибелі клітин-мішеней в процесі тривалої інкубації), навіть при використанні відповідних спеціальних барвників для виявлення загиблих клітин-мішеней.

В основу способу-прототипу [4] покладено облік переважно функціональних змін пухлинних клітин-мішеней під дією цитотоксичних клітин людини. Оцінку цитотоксичного ефекту здійснюють шляхом мічення клітин-мішеней радіоактивним хромом-51. Відомо [3, 2], що цитотоксичний ефект проявляється тільки при безпосередньому контакті клітин-ефекторів і клітин-мішеней в результаті продукування клітинами-ефекторами різних цитокінів та перфорінов з подальшим вивільненням зазначених медіаторів. У способі-прототипі цей контакт здійснюється після спонтанного осідання всіх клітин суміші на дно пробірки, яке завершується через 3-5 годин. Після осідання клітин суміші і виникнення контакту між клітинами-мішенями і цитотоксичними клітинами починається продукція і вивільнення цитотоксичних медіаторів, а й вплив їх на клітини-мішені, що займає 12-140 годин. Таким чином, для прояву цитотоксичного ефекту щодо пухлинних клітин потрібно інкубація протягом не менше 16 годин, що обумовлює тривалість процедури визначення. Крім того, необхідною умовою для забезпечення контакту клітин-ефекторів і клітин-мішеней і відповідно для отримання вираженого цитотоксичного ефекту щодо пухлинних клітин згідно способу-прототипу є відносно високе співвідношення між мононуклеарами і клітинами-мішенями (50: 1). Здійснення зазначеного умови на практиці призводить до необхідності роботи з відносно великим об'ємом крові, що в свою чергу виключає можливість отримання крові для дослідження з пальця пацієнта (використовують тільки венозну кров).

В процесі інкубації суміші мононуклеарів і пухлинних клітин-мішеней під впливом цитотоксичних мононуклеаров змінюється проникність клітинних мембран клітин-мішеней, у результаті чого відбувається вивільнення з клітин-мішеней ⁵¹ Сr. Однак навіть при дотриманні передбачених методикою способу-прототипу оптимальних умов змішування і інкубації суміші відсутність у пухлинних клітин-мішеней особливих специфічних високочутливих рецепторів до медіаторів клітин-ефекторів може в ряді випадків приводити до недостатньої вираженості функціональних змін клітин-мішеней в ході цитотоксической реакції.

Зокрема підвищення проникності клітинних мембран може виявитися недостатнім для виходу ⁵¹ Сr (за даними авторів винаходу в суміші залишається 40-80% клітин-мішеней з непошкодженими мембранами). У цих випадках буде мати місце відносно низький специфічний (тобто обумовлений впливом цитотоксичних мононуклеаров) вихід ⁵¹ Сr в досвіді, що призведе до отримання ложнозаніженних результатів цитотоксической реакції. Крім того, при використанні ⁵¹ Сr як індикатор цитотоксичного ефекту по ряду причин (якість клітин-мішеней, якість інкубаційних середовищ і посуду, недостатня кваліфікація середнього медичного персоналу і т.п.) може спостерігатися підвищений спонтанний (неспецифічний) вихід зазначеного радіонукліду в контролі (16-50%). Це істотно ускладнює облік результатів цитотоксической реакції, обумовлюючи ложнозаніженние результати визначення, а в ряді випадків (при спонтанному виході ⁵¹ Сr в контролі більше 20%) робить облік результатів реакції практично неможливим.

Щодо низькі міцнісні характеристики мембран пухлинних клітин-мішеней обумовлюють відносно високу ймовірність пошкодження цих клітин в результаті піпетування, центрифугування (на стадії приготування клітин-мішеней), внесення розчинів в суміш мононуклеаров і клітин-мішеней і т. Д. Це знаходить відображення у відносно високому спонтанному (неспецифічний) виході ⁵¹ Сr в досвіді, який, за даними авторів винаходу, може в ряді випадків досягати 30-40%, що призводить до ложнозавишенним результатами визначення. Все це обумовлює відносно низьку точність визначення СКЦ за допомогою способу-прототипу. І нарешті, передбачене методикою способу-прототипу [4] застосування ⁵¹ Сr передбачає роботу з матеріалом, міченим зазначеним радіонуклідом, що вимагає спеціально обладнаній лабораторії і спеціально навченого персоналу.

Завданням винаходу є створення способу визначення СКЦ, що забезпечує можливість суправітально, раннього і вираженого морфологічного прояву цитотоксичного ефекту при виключенні можливості спонтанного лізису клітин-мішеней, механічних пошкоджень їх мембран і спонтанного виходу радіоактивного ізотопу з клітин-мішеней, за рахунок використання клітин, що володіють особливими, специфічними високочутливими рецепторами до медіаторів, що продукується цитотоксическими клітинами людини, великими цитоплазматическими гранулами, здатними до екзоцитозу, і відносно високою механічною міцністю мембран.

Поставлена ​​задача вирішується тим, що в способі визначення СКЦ, що включає виділення мононуклеарів з периферичної крові пацієнта, приготування клітин-мішеней, змішування мононуклеаров і клітин-мішеней, инкубирование суміші мононуклеарів і клітин-мішеней з подальшим урахуванням результатів цитотоксической реакції, відповідно до винаходу в якості клітин мішеней використовують гладкі клітини щурів. Змішують мононуклеари і огрядні клітини щурів в співвідношенні 20-30: 1. Безпосередньо після змішування мононуклеаров і огрядних клітин щурів додатково центрифугируют отриману суміш. Інкубування суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів виробляють протягом 30 хв. Облік результатів цитотоксической реакції здійснюють шляхом підрахунку кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів у відсотках від загальної кількості огрядних клітин щурів в суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів і при значенні цього показника, що становить менше 25%, визначають знижену СКЦ, при значенні цього показника 25-35% визначають нормальну СКЦ, а при значенні цього показника понад 35% визначають підвищену СКЦ. Найбільш ефективно, коли в ході обліку результатів цитотоксической реакції безпосередньо перед підрахунком кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів в суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів виробляють перемішування клітинного осаду і супернатанта суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів.

Вибір оптимальних режимів і умов здійснення дій заявленого способу, що забезпечують найбільшу ефективність винаходу при його реалізації, здійснювали наступним чином.

Для встановлення діагностично значущих діапазонів цитотоксичної активності клітин крові людини в нормі і при патології були проведені порівняльні дослідження СКЦ у наступних пацієнтів:

- У практично здорових дітей;

- У дітей з дефектами противірусного імунітету, що, як відомо [3, 6, 7], є свідченням знижених функцій нормальних кілерів - головних клітин, що відповідають за СКЦ;

- У дітей з вираженою реакцією "господар проти трансплантата", клінічно проявляється відторгненням пересадженої тканини, що, як відомо [1, 6, 3], обумовлено значним підвищенням активності цитотоксичних клітин.

Розподіл пацієнтів за групами виглядало наступним чином:

I група - практично здорові діти у віці від 3 до 16 років - 26 осіб;

II група - діти (віком від 3 до 16 років) з частими гострими респіраторними вірусними захворюваннями / ГРВІ / (більше 8 разів на рік), підтвердженими за допомогою вірусологічних методів обстеження (імунофлуоресцентний методи дослідження мазків - відбитків зі слизової носа і горла, дослідження парних сироваток на антитіла до респіраторних вірусів) - 31 чол .;

III група - опікові хворі (у віці від 3 до 16 років) з кризом відторгнення пересадженого шкірного клаптя - 6 чол.

СКЦ в кожній із зазначених груп визначали з використанням заявленого способу і способу-прототипу [4]. При цьому в ході визначення СКЦ і заявленим способом і способом-прототипом для забезпечення адекватності умов постановки експериментів кров кожного пацієнта досліджували в трьох паралельних дослідах з трьома паралельними контролями (3 досвідчені і 3 контрольні проби). При визначенні СКЦ за методикою способу-прототипу активність досвідчених і контрольних проб заміряли на лічильнику радіоактивності "Ultra-Gamma 1280" (виробництва LKB, Швеція).

Статистичну обробку результатів проводили шляхом обчислення сигмального відхилення (s), а й шляхом точного обчислення значущості відмінностей часткою за методом j (кутового перетворення Фішера) [8].

Результати порівняльних досліджень СКЦ в групах I - III представлені в таблиці 1.

З даних таблиці 1 видно, що у практично здорових пацієнтів (група I) кількість дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів в суміші від загальної кількості огрядних клітин щурів мононуклеаров і клітин-мішеней (% дегрануляции) склало в середньому (30 ± 2,5)% при варіюванні значень зазначеного показника в межах 25-35%. Цей інтервал був прийнятий в якості діапазону значень, що характеризують нормальну СКЦ. У II групі пацієнтів (з підтверджено зниженими функціями цитотоксичних клітин)% дегрануляции склав в середньому (18 ± 3,0) при коливанні значень зазначеного показника в інтервалі 12-24% (р <0,001 у порівнянні з показниками, отриманими в I групі). У зв'язку з цим було прийнято, що показником зниженою СКЦ є% дегрануляции, що становить менше 25%. У III групі пацієнтів (з підтверджено підвищеною активністю цитотоксичних клітин) на підставі отриманого середнього значення% дегрануляции, рівного (45 ± 4,0)%, і меж його відхилень 37-53% (при р <0,001 у порівнянні з показниками, отриманими в I групі), було прийнято, що підвищена СКЦ може бути діагностована при значенні цього показника понад 35%.

Дані таблиці 1 свідчать і про те, що при визначенні СКЦ за методикою способу-прототипу [4] авторами винаходу були отримані значення СКЦ, зіставні з даними, наведеними авторами способу-прототипу в цитованій роботі. Так, певний авторами винаходу за методикою способу-прототипу середній рівень СКЦ у практично здорових пацієнтів склав (54 ± 4)%; за даними авторів способу-прототипу аналогічний показник становив (53,6 ± 3,7)%. Кореляція значень СКЦ, визначених за методикою способу-прототипу [4] авторами винаходу і авторами способу-прототипу, спостерігалася і і для пацієнтів з підвищеною і зниженою СКЦ, зокрема для хворих з кризом відторгнення трансплантата (див. Графу 6 таблиці 1 опису винаходу і таблицю 65 на с. 162 опису способу-прототипу [4]).

Для встановлення оптимального співвідношення мононуклеаров і огрядних клітин щурів в суміші досліджували вплив різних співвідношень на точність визначення СКЦ. Для дослідження були попередньо відібрані 10 практично здорових дітей (у віці від 3 до 16 років), у яких значення СКЦ знаходилися в межах 28-32%. У кожного з пацієнтів визначали СКЦ при співвідношеннях мононуклеаров і огрядних клітин щурів в суміші, що становлять: 5: 1, 10: 1, 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1. При цьому кров кожного з пацієнтів при кожному випробовуваному співвідношенні мононуклеаров і заявлених клітин-мішеней досліджували в трьох паралельних пробах з трьома паралельними контролями (3 досвідчені і 3 контрольні проби). Кожне з співвідношень перевіряли за інших фіксованих оптимальних режимах і умовах здійснення дій заявленого способу.

Статистичну обробку результатів проводили аналогічно обробці результатів експериментів по встановленню діагностично значущих діапазонів СКЦ в нормі і при патології.

Результати досліджень наведені в таблиці 2.

З даних таблиці 2 випливає, що оптимальним є співвідношення мононуклеаров і огрядних клітин щурів в суміші, що становить 20-30: 1, тому що саме це співвідношення забезпечує максимально високий відсоток специфічно пошкоджених клітин-мішеней, чутливих до дії цитотоксичних мононуклеаров, при мінімальному розкид результатів в паралельних дослідах. При більш низьких співвідношеннях між мононуклеарами і заявленими клітинами-мішенями (5-15: 1) спостерігається більш низький відсоток дегрануліровавшіх клітин-мішеней (5-18%), що свідчить про те, що не всі клітини-мішені, чутливі до дії цитотоксичних клітин , піддалися цитолизу. При підвищенні (в порівнянні з оптимальним) співвідношення мононуклеаров і клітин-мішеней (30-50: 1), незважаючи на те, що всі клітини-мішені, чутливі до дії цитотоксичних мононуклеаров, піддаються цитолізу (30-32%), відзначається відносно великий розкид результатів в паралельних дослідах. Останнє, мабуть, може бути обумовлено вступом в силу механічних або інших чинників, що перешкоджають контакту цитотоксичних клітин і клітин-мішеней, або дії цитотоксичних медіаторів, що негативно впливає на відтворюваність результатів реакцій і тим самим знижує точність визначення СКЦ.

Для встановлення значимості стадії центрифугування в сукупності дій заявленого способу, а й оптимального часу інкубації досліджували вплив наявності чи відсутності стадії центрифугування в поєднанні з різними термінами інкубації на точність визначення СКЦ. Для проведення експериментів був обраний стандартний режим центрифугування (протягом 10 хв при 600g), рекомендований щодо мононуклеарів периферичної крові [7]. Для дослідження були попередньо відібрані 10 практично здорових дітей (у віці від 3 до 16 років), у яких значення СКЦ знаходилися в межах 28-32%. У кожного з пацієнтів визначали СКЦ при наявності і за відсутності стадії центрифугування в послідовності дій заявленого способу, при цьому терміни інкубації в кожному випадку варіювали від 15 до 240 хв при інших фіксованих оптимальних режимах і умовах здійснення дій заявленого способу. Кров кожного пацієнта в кожному з варіантів постановки експерименту досліджували в трьох паралельних дослідах з трьома паралельними контролями (3 досвідчені і 3 контрольні проби).

Статистичну обробку результатів проводили аналогічно обробці результатів експериментів по встановленню діагностично значущих діапазонів СКЦ в нормі і при патології.

Результати досліджень наведені в таблиці 3.

Попередньо авторами винаходу була проведена перевірка придатності прийнятого відповідно до рекомендацій [7] режиму центрифугування для цілей заявленого способу. При цьому в результаті експериментів було встановлено, що, з одного боку, при центрифугуванні суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів в зазначеному режимі осідають на дно пробірки 100% мононуклеаров і 100% клітин-мішеней, що підтверджувалося відсутністю зазначених клітин в надосадової рідини (супернатанті) після центрифугування. З іншого боку, при центрифугуванні в зазначеному режимі практично не відбувається механічного пошкодження клітин-мішеней, зокрема їх мембран. Це підтверджувалося тим, що, по-перше, кількість заявлених клітин-мішеней до і після центрифугування залишалося постійним; по-друге, в контрольних пробах (без мононуклеаров) дегрануляції тучних клітин щурів в результаті центрифугування (при оптимальному терміні інкубації) практично не відзначалося (кількість дегрануліровавшіх клітин в контролі після центрифугування становило 0%). У зв'язку з цим зазначений режим був прийнятий в якості робочого (далі - "робочий режим центрифугування").

Дані таблиці 3 показують, що при відсутності стадії центрифугування в послідовності дій заявленого способу при невеликих термінах інкубації (15-60 хв) цитотоксичний ефект щодо заявлених клітин-мішеней практично не проявляється, що виключає можливість визначення СКЦ. При збільшенні термінів інкубації понад 60 хв цитотоксичний ефект наростає, проте відсоток специфічно пошкоджених клітин-мішеней, чутливих до дії цитотоксичних мононуклеаров, залишається відносно низьким (12-21%), що перешкоджає достовірній оцінці СКЦ. Крім того, при термінах інкубації понад 60 хв наростає процес спонтанної дегрануляції огрядних клітин щурів (кількість дегрануліровавшіх клітин в контролі становить залежно від часу інкубації 3-20%). Таким чином, наведені результати експериментів свідчать про те, що під час відсутності стадії центрифугування облік результатів цитотоксической реакції є практично неможливим.

З таблиці 3 видно і, що при центрифугуванні в робочому режимі суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів в поєднанні з подальшою інкубацією суміші максимальне специфічне пошкодження заявлених клітин-мішеней, чутливих до дії цитотоксичних клітин, досягається, починаючи з часу інкубації 30 хв. З огляду на, що при цьому відзначається мінімальний розкид результатів в паралельних дослідах, вказаний термін інкубації прийнятий в якості оптимального. При збільшенні терміну інкубації суміші (45-120 хв) кількість дегрануліровавшіх клітин-мішеней залишається практично постійним, проте збільшується розкид результатів в паралельних дослідах. Останнє обумовлено починаються процесами спонтанної дегрануляції огрядних клітин щурів (як початкового прояви неспецифічного лізису зазначених клітин), що підтверджується наростанням% дегрануляции в контролі (1-3%). Це знижує відтворюваність результатів цитотоксичних реакцій і відповідно точність визначення СКЦ.

При подальшому збільшенні терміну інкубації суміші (понад 120 хв) спостерігається істотне підвищення кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів в контролі (11-22%), що свідчить про наростання процесів неспецифічного лізису клітин. Це призводить до значного заниження результатів цитотоксичних реакцій, що відповідно виключає можливість визначення СКЦ. Таким чином, аналіз результатів експериментів, представлених в таблиці 3, дозволяє зробити висновок, що центрифугування суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів є суттєвою ознакою заявленого способу, тому що зазначена стадія (її наявність в послідовності дій способу) безпосередньо впливає на досягнення заявленого результату. При цьому саме поєднання центрифугування суміші з подальшою її инкубацией забезпечує можливість вибору оптимального часу інкубації (30 хв), що дозволяє отримати найбільшу точність визначення СКЦ.

Для порівняння авторами винаходу були проведені експерименти по оцінці можливості введення стадії центрифугування в сукупність дій способу-прототипу [4]. При цьому перевірялася придатність двох стандартних режимів центрифугування:

- Режиму, рекомендованого щодо пухлинних клітин мієлоїдної лінії відповідно до методики способу-прототипу [4] (протягом 5 хв при 150g) - режим 1;

- Режиму, рекомендованого щодо мононуклеарів периферичної крові [7] (протягом 10 хв при 600g) - режим 2 (робочий режим центрифугування в заявленому способі).

Було встановлено, що центрифугованих в режимі 1 призводило до недостатнього осідання мононуклеаров - в надосадової рідини залишалося 15-30% мононуклеаров, що призводило до кінцевого порушення співвідношення мононуклеаров і клітин-мішеней способу-прототипу в суміші, що в свою чергу знижувало точність визначення СКЦ. Крім того, спонтанний вихід ⁵¹ Сr в контролі зростав до 25-30%, що свідчило про механічне пошкодження значної частини клітин мішеней (зокрема, їх мембран) в процесі центрифугування. Зазначені негативні чинники в сукупності виключали можливість визначення СКЦ. Центрифугування в режимі 2 робило практично неможливим облік результатів цитотоксической реакції через високий (50-60%) спонтанного виходу ⁵¹ Сr в контролі, що свідчило про механічному пошкодженні переважної більшості клітин-мішеней (зокрема, їх мембран) в процесі центрифугування. Таким чином, введення центрифугування (як в режимі 1, так і в режимі 2) в послідовність дій способу-прототипу призводило до неможливості визначення СКЦ за методикою способу-прототипу.

Досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату обумовлено наступним. Відомо, що під дією алергенів відбувається дегрануляция попередньо сенсибілізованих сироваткою крові хворого огрядних клітин щурів. Морфологічно це проявляється виходом з клітин цитоплазматических гранул, які мають досить великі розміри, що дозволяють враховувати процес дегрануляції під мікроскопом. При цьому сенсибілізація огрядних клітин щурів сироваткою крові хворого в ході визначення причинно значущого алергену є необхідним етапом для отримання реакції дегрануляції [9]. Останнє обумовлено тим, що початково на поверхні тучних клітин щурів відсутні алерген-специфічні імуноглобуліни Е (IgE) людини, що відповідають за створення і функціонування рецепторного комплексу, необхідного для відповіді на алерген.

Авторами заявленого рішення не виявлено джерел інформації, де були б описані зміни огрядних клітин щурів в ході цитотоксичних реакцій. Автори винаходу експериментально встановили, що при реалізації заявленої сукупності дій при оптимальних умовах і режимах їх здійснення під впливом цитотоксичних мононуклеаров відбувається дегрануляції тучних клітин щурів без попередньої сенсибілізації останніх сироваткою крові хворого, що є проявом антітелонезавісімой клітинної цитотоксичності. На думку авторів запропонованого способу, це може бути обумовлено тим, що огрядні клітини щурів початково мають особливі специфічними високочутливими рецепторами до перфоріном та цитокінів, які продукуються цитотоксическими мононуклеарами людини. Можливо і, що цитотоксичні мононуклеари можуть продукувати особливі цитокіни, здатні цілеспрямовано впливати на рецептори і / або на мембрани тучних клітин щурів. Тому для створення і функціонування рецепторного комплексу, чутливого до цитотоксичної дії клітин-ефекторів, не потрібно попередньої сенсибілізації заявлених клітин-мішеней сироваткою крові хворого.

Результати експериментальних досліджень авторів винаходу показали, що дегрануляції тучних клітин щурів при цитотоксичних реакціях морфологічно проявляється екзоцитозу - виходом на поверхню зазначених клітин прозорих досить великих гранул, чітко помітних під мікроскопом. При цьому встановлено, що спільна інкубація клітин-ефекторів і заявлених клітин-мішеней протягом заявленого періоду часу (30 хв) не призводить до загибелі клітин-мішеней. Все це дозволяє здійснювати облік суправітально морфологічних змін тучних клітин щурів - їх дегрануляцію під дією цитотоксичних клітин людини. Можливість оцінювати результати цитотоксичних реакцій по морфологічних змін клітин-мішеней в свою чергу дозволяє виключити необхідність мічення останніх радіоактивним ізотопом. Це, з одного боку, дає можливість уникнути необхідності брати до уваги здатність клітин-мішеней до спонтанного вивільнення радіонукліда навіть під час відсутності клітин-ефекторів і тим самим дозволяє забезпечити оптимальний контроль реакції, за рахунок чого і підвищується точність визначення СКЦ. З іншого боку, виключається необхідність проводити аналіз в спеціально обладнаній для роботи з радіоактивними ізотопами лабораторії і за участю спеціально навченого персоналу.

Наличие у заявленных клеток-мишеней особых специфических высокочувствительных рецепторов к действию клеток-эффекторов обеспечивает возможность раннего проявления выраженного цитотоксического эффекта даже при минимальных количествах перфоринов и цитокинов, продуцируемых мононуклеарами. Это позволяет получить значимый цитотоксический эффект и соответственно обеспечить относительно высокую точность определения при относительно низком соотношении клеток-эффекторов и заявленных клеток-мишеней (20-30:1). В результате появляется возможность проведения качественного анализа при использовании относительно небольшого количества крови, что дает возможность получения крови для исследования не только из вены, но и из пальца пациента.

Введение в совокупность действий заявленного способа дополнительной (по сравнению с прототипом) стадии - центрифугирования смеси мононуклеаров и клеток-мишеней - позволяет обеспечить ускоренное осаждение клеток, способствуя достижению более раннего и более тесного контакта между

клетками-эффекторами и клетками-мишенями и соответственно более раннему продуцированию и высвобождению цитотоксических медиаторов клеток-эффекторов и их воздействию на клетки-мишени.

При этом авторами изобретения экспериментально установлено, что степень механического повреждения мембран тучных клеток крыс в результате центрифугирования в рабочем режиме недостаточна для спонтанной дегрануляции указанных клеток, что подтверждалось практически полным отсутствием (0%) дегранулировавших клеток в контроле (при оптимальном режиме инкубации). Напротив, при центрифугировании используемых в способе-прототипе опухолевых клеток миелоидной линии механические повреждения значительной части этих клеток (в частности их мембран) отмечались даже при использовании режима (5 мин при 150g), рекомендованного для данных клеток методикой способа-прототипа [4] (спонтанный выход ⁵¹ Сr в контроле 25-30%). При центрифугировании в режиме (10 мин при 600g), рекомендованном для мононуклеаров периферической крови [7] (рабочий режим заявленного способа), механические повреждения клеток-мишеней становились еще более значимыми (спонтанный выход ⁵¹ Сr в контроле 50-60%). Таким образом, результаты сравнительных экспериментальных исследований авторов изобретения (приведенные выше) свидетельствовали о том, что при использовании заявленных клеток-мишеней (в отличие от клеток-мишеней способа-прототипа) центрифугирование не оказывает значимого негативного влияния на точность определения СКЦ, что обусловлено относительно высокой механической прочностью мембран тучных клеток крыс.

Использование в качестве клеток-мишеней тучных клеток крыс, обладающих особым специфическим рецепторным аппаратом и прочностными характеристиками мембран, позволяющими искусственно ускорить процесс осаждения клеток, в сочетании с включением центрифугирования (как дополнительной по сравнению с прототипом стадии) в совокупность действий заявленного способа обусловливают возможность получения выраженного цитотоксического эффекта при относительно коротких сроках инкубации (30 мин). Заявленные сроки инкубации в свою очередь позволяют исключить возможность неспецифического лизиса тучных клеток крыс, начальные проявления которого в виде спонтанной дегрануляции клеток отмечаются при сроках инкубации 45-60 мин и достигают значимых величин через 2-3 час инкубации. Это и вносит существенный вклад в повышение точности определения СКЦ.

Перемешивание клеточного осадка и супернатанта смеси мононуклеаров и тучных клеток крыс, осуществляемое непосредственно перед подсчетом количества дегранулировавших клеток-мишеней, позволяет разрушить образовавшиеся при центрифугировании конгломераты клеток смеси, что облегчает морфологическую оценку результатов реакции - подсчет дегранулировавших тучных клеток крыс под микроскопом. Это способствует дополнительному повышению точности определения СКЦ.

Таким образом, морфологические и функциональные особенности заявленных клеток-мишеней (наличие особого специфического рецепторного аппарата, специфические характеристики цитоплазматических гранул, прочностные характеристики мембран), наличие дополнительного действия (центрифугирования), а и заявленные (оптимальные) режимы и условия осуществления действий способа (смешивания мононуклеаров и клеток-мишеней, инкубации) в совокупности обеспечивают возможность учета суправитальных морфологических изменений клеток-мишеней (их дегрануляцию), специфически обусловленных действием цитотоксических клеток человека.

В результате заявленная совокупность признаков в их взаимосвязи позволяет добиться суправитального раннего и выраженного морфологического проявления цитотоксического эффекта при исключении эндогенных и экзогенных значимых негативных факторов, непосредственного влияющих на учет результатов цитотоксической реакции (спонтанного лизиса клеток-мишеней, механических повреждений их мембран, спонтанного выхода радиоактивного изотопа из клеток-мишеней). Это в свою очередь позволяет повысить точность определения СКЦ, сократить сроки проведения анализа, исключить необходимость работы с радиоактивным изотопом. При этом из известного уровня техники не выявляется, по мнению заявителя, влияния предписываемых изобретением преобразований, характеризуемых отличительными от прототипа существенными признаками, на достижение технического результата.

Спосіб здійснюють наступним чином. У пацієнта з пальця або з вени беруть кров в кількості 0,5 мл в пробірку, змочену гепарином. З взятої периферичної крові виділяють мононуклеари за стандартною методикою, наприклад викладеної в роботі [7]. При цьому кров розводять в два рази 0,9% розчином NaCl, нашаровуються на суміш Ficoll-Pack 1,077 г / см ³ і центрифугують протягом 30 хв при 400g. Утворене в інтерфазі "кільце" мононуклеаров знімають піпеткою, отриману клітинну суспензію тричі відмивають 0,9% розчином NaCl і доводять концентрацію до 2х10 ⁶ клітин / мл. Гладкі клітини щурів отримують за методикою Л.М. Ішімовой і Л.І. Зеліченко [9]. При цьому білу щура-самця з масою тіла понад 140 г присипляють під ефірним наркозом і вводять в його черевну порожнину підігріту до температури 37 ^o С середу Хемоцелл в кількості 3-5 мл. Проводять масаж черевної порожнини щура протягом 2-3 хв, після чого черевну порожнину пошарово розкривають і рідина з огрядними клітинами щури збирають в посудину, підігрітий до температури 37 ^o С. Клітини тричі відмивають середовищем 199 і доводять концентрацію клітин до 1х10 ⁵ клітин / мл . Після цього в дослідну центрифужную пробірку вносять 25-38 мкл суспензії мононуклеарів і 25 мкл суспензії огрядних клітин щура (співвідношення мононуклеаров і клітин-мішеней у дослідних пробах відповідає 20-30: 1). До контрольної центрифужную пробірку вносять 25 мкл суспензії огрядних клітин щура і 25-38 мкл середовища 199. Досвідчену і контрольну пробірки центрифугують протягом 10 хв при 600g, потім поміщають в термостат і інкубують протягом 30 хв при температурі 37 ^o С.

Після закінчення інкубації вміст у дослідній і в контрольній пробірках струшують для перемішування клітинного осаду і супернатанта (надосадової рідини). Потім клітинні суспензії з дослідної та контрольної пробірок переносять на предметне скло (з кожної пробірки - на окреме скло), попередньо пофарбовані спиртовим розчином нейтрального червоного. Краплі клітинних суспензій дослідної та контрольної проб, поміщені на предметні скельця, закривають зверху покривним склом, краї яких змащені вазеліном (для запобігання випаровування рідини). Підраховують, наприклад під мікроскопом при збільшенні 15х25, кількість дегрануліровавшіх огрядних клітин щура в процентах від загальної кількості огрядних клітин щура в дослідній пробі і в контрольній пробі (далі - відповідно "% дегрануляции в досвіді" і "% дегрануляции в контролі"). СКЦ визначають як різницю% дегрануляции в досвіді і% дегрануляции в контролі (далі - "% дегрануляции"). При значенні% дегрануляции, що становить менше 25, визначають знижену СКЦ, при значенні цього показника 25-35% визначають нормальну СКЦ, а при значенні цього показника понад 35% визначають підвищену СКЦ.

Винахід ілюструється такими прикладами.

Приклад 1.

Альоша К., 7 років. Обстежено в рамках скринінгової програми виявлення схильності до частих респіраторних захворювань в дитячій поліклініці при Дитячій міській лікарні 1 Санкт-Петербурга (ДГБ 1). В анамнезі у пацієнта відзначені рідкісні ГРВІ (1-2 рази на рік). При диспансерному обстеженні патології з боку внутрішніх органів не виявлено.

У пацієнта була визначена СКЦ з використанням заявленого способу. В ході визначення з пальця дитини взяли кров в кількості 0,5 мл в пробірку, змочену гепарином. З взятої периферичної крові виділили мононуклеари за стандартною методикою [7]. При цьому кров розводили в два рази 0,9% розчином NaCl, нашаровуються на суміш Ficoll-Pack 1,077 г / см ³ і центрифугували протягом 30 хв при 400g. Утворене в інтерфазі "кільце" мононуклеаров знімали піпеткою, отриману клітинну суспензію тричі відмивали 0,9% розчином NaCl і доводили концентрацію до 2х10 ⁶ клітин / мл. Гладкі клітини щура отримували за методикою Л.М.Ішімовой і Л.І. Зеліченко [9]. При цьому білу щура-самця з масою тіла понад 140 г присипляли під ефірним наркозом і вводили в його черевну порожнину підігріту до температури 37 ^o С середу Хемоцелл в кількості 3-5 мл.

Виробляли масаж черевної порожнини щура протягом 2-3 хв, після чого черевну порожнину пошарово розкривали і рідина з огрядними клітинами щури збирали в посудину, підігрітий до температури 37 ^o С. Клітини тричі відмивали середовищем 199 і доводили концентрацію клітин до 1х10 ⁵ клітин / мл . Кров пацієнта досліджували в трьох паралельних дослідах з трьома паралельними контролями (3 досвідчені і 3 контрольні пробірки.). У кожну дослідну центрифужную пробірку вносили 25 мкл суспензії мононуклеарів і 25 мкл суспензії огрядних клітин щура (співвідношення мононуклеаров і огрядних клітин щура в дослідних пробах відповідало 20: 1). У кожну контрольну центрифужную пробірку вносили 25 мкл суспензії огрядних клітин щура і 25 мкл середовища 199. Досвідчені і контрольні пробірки центрифугували протягом 10 хв при 600g, потім помістили в термостат і інкубували протягом 30 хв при температурі 37 ^o С.

Після закінчення інкубації вміст в досвідчених і в контрольних пробірках струшували для перемішування клітинного осаду і супернатанта. Потім клітинні суспензії з досвідчених і контрольних пробірок перенесли на предметні скельця (з кожної пробірки - на окреме скло), попередньо пофарбовані спиртовим розчином нейтрального червоного. Краплі клітинних суспензій досвідчених і контрольних проб, поміщені на предметні скельця, закрили зверху покривним склом, краї яких були змащені вазеліном. За допомогою мікроскопа "БІМАМ Р-11" (виробництва "ЛОМО", Санкт-Петербург) підраховували (при збільшенні 15х25) в кожній з досвідчених і контрольних проб 100 огрядних клітин щура; з їх числа відзначали дегрануліровавшіе огрядні клітини щура; кількість дегрануліровавшіх огрядних клітин щура висловлювали в% від 100 підрахованих огрядних клітин щура (відповідно% дегрануляции в досвіді і% дегрануляции в контролі) (див. табл. А).

Визначили СКЦ як різниця% дегрануляции в досвіді і% дегрануляции в контролі в кожній з пар (% дегрануляции _I,% дегрануляции _II,% дегрануляции _III):

% Дегрануляции _I = 28%

% дегрануляции _II = 30%

% дегрануляции _III = 29%

Вирахували середнє (з 3-х проб) значення СКЦ (% дегрануляции _пор.):

% Дегрануляции _пор. = 29%

Отримане значення СКЦ (29%) попадало в діапазон нормальних значень СКЦ, що дозволило розцінити СКЦ даного пацієнта як нормальну. Час, витрачений на процедуру визначення, склала 2 години 5 хвилин (2,08 год) (за результатами хронометрування авторів винаходу).

Паралельно проводили визначення СКЦ за допомогою способу-прототипу за методикою [4]. При цьому кров пацієнта досліджували в трьох паралельних дослідах з трьома паралельними контролями (3 досвідчені і 3 контрольні проби). Активність досвідчених і контрольних проб заміряли на лічильнику радіоактивності "Ultra-Gamma 1280" (виробництва LKB, Швеція). Середнє (з 3-х проб) значення СКЦ (% лізису), визначене за формулою, наведеною в методиці [4], склало 55,2%, що відповідало рівню норми способу-прототипу. Тривалість процедури визначення склала 89 годин 10 хвилин (89,2 ч) (за результатами хронометрування авторів винаходу).

Таким чином, значення СКЦ, отримані як за допомогою заявленого способу, так і способу-прототипу, потрапляли до відповідних інтервали значень, що характеризують нормальну СКЦ. Це підтверджувалося і результатами клінічного обстеження дитини, а й спостереженнями за ним в динаміці протягом 2-х років (за 2 роки дитина 1 раз перехворів риновирусной інфекцією), які свідчили про відсутність дефектів імунітету у даної дитини. Інших захворювань у обстежуваного дитини не виявлено. У зазначеному випадку мало місце збіг результатів визначення СКЦ за допомогою заявленого способу і способу-прототипу, причому результати визначення СКЦ корелювали з клінічними даними.

Приклад 2.

Наталя К., 16 років. Звернулася в дитячу поліклініку при ДГБ 1 зі скаргами на часті простудні захворювання (ГРВІ 1-2 рази на місяць), які відзначалися протягом останніх 6 років. Захворювання в частині випадків (при госпіталізації хворої в стаціонари при важких ГРВІ, бронхітах) підтверджувалися вірусологічними методами дослідження (імунофлуоресцентний дослідження мазків-відбитків зі слизової носа і горла, дослідження парних сироваток на антитіла до респіраторних вірусів). При дослідженні імунного статусу хворий кількість Т- і В-лімфоцитів, рівень імуноглобулінів (IgA, IgM, IgG) відповідали нормальним віковим показниками.

У пацієнтки проведено визначення СКЦ з використанням заявленого способу і способу-прототипу аналогічно прикладу 1.

При визначенні СКЦ з використанням заявленого способу в кожну дослідну центрифужную пробірку вносили 31 мкл суспензії мононуклеарів і 25 мкл суспензії огрядних клітин щура (співвідношення мононуклеаров і огрядних клітин щура в дослідних пробах відповідало 25: 1). У кожну контрольну центрифужную пробірку вносили 25 мкл суспензії огрядних клітин щура і 31 мкл середовища 199. Результати визначення наведені в табл. Б.

% Дегрануляции _I = 12%

% Дегрануляции _II = 13%

% Дегрануляции _III = 12%

% Дегрануляции пор. = 12,3%

Отримане середнє значення показника СКЦ (12,3%) дозволило зробити висновок про знижену (в порівнянні з нормою) СКЦ у обстежуваної пацієнтки. На процедуру визначення витрачено 2 години 30 хвилин (2,5 ч).

Результати визначення СКЦ за допомогою способу-прототипу: середня (з 3-х проб) значення СКЦ (% лізису) склало 58,1%, що з свідчило про знаходження СКЦ у хворої в межах норми. Процедура визначення зайняла 88 годин 15 хвилин (88,3 ч).

При спостереженні за хворою в динаміці протягом 14 місяців, незважаючи на проведене лікування (ІРС-19, рибомунил), частота ГРВІ залишалася досить високою (1 раз в 1-2 місяці), хоча і знизилася в порівнянні з частотою ГРВІ, що спостерігалася до лікування .

Таким чином, результати клінічного обстеження пацієнтки та спостереження в динаміці дозволяли зробити висновок про те, що в даному випадку має місце знижена противірусна резистентність, яка обумовлена ​​активністю клітин, що володіють СКЦ. Це підтвердило результати визначення, отримані за допомогою заявленого способу, і дало можливість розцінити результати визначення СКЦ за способом-прототипу як ложнозавишенние.

Приклад 3.

Саша К., 3 роки. Поступив на опікове відділення ДГБ 1 з діагнозом: Термічний опік стегон, гомілки, S = 25%, II А-III ступеня.

Хворому було пересаджено шкіра людського ембріона. Починаючи з 2-х діб після операції пересадки шкіри, щодня проводилося моніторування реакції відторгнення трансплантата з допомогою заявленого способу і способу-прототипу аналогічно прикладу 1.

При визначенні СКЦ з використанням заявленого способу в кожну дослідну центрифужную пробірку вносили 38 мкл суспензії мононуклеарів і 25 мкл суспензії огрядних клітин щура (співвідношення мононуклеаров і огрядних клітин щура в дослідних пробах відповідало 30: 1). У кожну контрольну центрифужную пробірку вносили 25 мкл суспензії огрядних клітин щура і 38 мкл середовища 199.

Результати визначення наведені в табл. В.

Час, витрачений на процедуру визначення з використанням заявленого способу і способу-прототипу, склало відповідно 2 години 10 хвилин (2,2 години) і 89 годин 30 хвилин (89,5 ч).

На 10-й день після операції був клінічно зареєстрований криз відторгнення трансплантата - пересадженою ембріональної шкіри. Таким чином, заявлений спосіб дозволив прогнозувати ймовірність кризу, тому що починаючи з 7-х діб після операції спостерігалося підвищення значень СКЦ в порівнянні з нормальними показниками СКЦ. СКЦ, певна за допомогою способу-прототипу, протягом усього терміну спостереження незначно коливалася, не виходячи за межі інтервалу нормальних значень СКЦ, що дозволило розцінити результати цитотоксичної реакції як ложнозаніженние. Прогнозувати ймовірність кризу відторгнення трансплантата з допомогою способу-прототипу не представлялося можливим.

За допомогою заявленого способу було обстежено in vitro 286 дітей у віці від 3-х до 16 років. При цьому під час обстеження 274 дітей заявлений спосіб був використаний в рамках скринінгової імунологічної програми виявлення схильності до частих респіраторних захворювань (група А). Крім того, заявлений спосіб був застосований для обстеження 12 опікових хворих (група В) з метою моніторування реакції відторгнення трансплантата (пересадженого шкірного клаптя). Дослідження проводили на базі Дитячої міської лікарні 1 Санкт-Петербурга (дитяча поліклініка при ДГБ 1; опікове відділення 36 ДГБ 1), а й на базі дитячої поліклініки 60 (Санкт-Петербурга) і обласної дитячої поліклініки. Критеріями ефективності визначення СКЦ з використанням заявленого способу служили точність визначення (кількість підтверджених результатів визначення), а й тривалість процедури визначення (за результатами хронометрування авторів винаходу). Для підтвердження наявності або відсутності відхилень від норми значень СКЦ проводили збір анамнезу, оцінку клінічної картини захворювання, клініко-інструментальне та клініко-лабораторне спостереження за хворими в динаміці.

Ті ж діти були паралельно обстежені за допомогою способу-прототипу [4]. Ефективність визначення СКЦ оцінювали за допомогою тих же критеріїв, що і в разі заявленого способу.

Статистичну обробку результатів проводили шляхом точного обчислення значущості відмінностей часткою за методом j (кутового перетворення Фішера) [8].

З даних таблиці 4 випливає, що заявлений спосіб забезпечив отримання клінічно підтверджених результатів визначення СКЦ в 100% випадків при відсутності ложнозаніженних і ложнозавишенних результатів визначення. При цьому в групі А знижена СКЦ була зареєстрована у 82 дітей (29,9%). У всіх цих дітей або (як правило) в анамнезі відзначалися часті (8-10 разів на рік) гострі респіраторні захворювання / ГРЗ / (ГРВІ, бронхіти, пневмонії), підтверджені клінічними, клініко-інструментальними, клініко-лабораторними та вірусологічними методами обстеження, або при спостереженні в динаміці спостерігалося різке збільшення частоти ГРЗ (до 8-10 разів на рік) у порівнянні з періодом, що передував імунологічному обстеженню. Нормальна СКЦ, зареєстрована в групі А у 191 дитини (69,7%), і підтверджувалася результатами клінічного обстеження і спостереженнями в динаміці (частота ГРЗ 1-2 рази на рік; відсутність інших захворювань). Підвищене значення СКЦ, отримане в групі А у 1 хворого, не було розцінено як ложнозавишенное, т. К. У даного хворого при клінічному обстеженні була виявлена ​​глистяні інвазії (аскаридоз). Передбачається, що клітини, які беруть участь в СКЦ, можуть брати участь і в захисті від гельмінтів, що призводить до підвищення активності цитотоксичних клітин.

У групі В підвищена СКЦ була виявлена ​​у 7 хворих (58,3%) на 7-8 день після трансплантації. У всіх цих хворих (в 100% випадків) на 10-14 день після трансплантації був клінічно зареєстрований криз відторгнення пересадженого шкірного клаптя. У 3-х хворих з пересадженим шкірним клаптем відзначалася нормальна СКЦ; у 2-х хворих групи В - знижена СКЦ. У жодного з цих хворих при спостереженні в динаміці не було зареєстровано кризів відторгнення трансплантата. При цьому в обох хворих зі зниженою СКЦ в анамнезі відзначалися часті ГРВІ (8 і 9 разів на рік), підтверджені клінічними, клініко-інструментальними, клініко-лабораторними та вірусологічними методами обстеження.

З даних таблиці 4 видно і, що отримані за допомогою способу-прототипу результати визначення СКЦ були підтверджені клінічно тільки в 65,0% випадків; в 28,3% випадків отримані показники СКЦ були розцінені як ложнозаніженние, а в 6,7% випадків - як ложнозавишенние результати визначення (р <0,001 у порівнянні з відповідними значеннями показників заявленого способу). При цьому в групі А знижена СКЦ, зазначена у 145 пацієнтів (52,9%), була підтверджена клінічно (аналогічно заявленому способу) тільки у 68 хворих (24,8%) (частота ГРЗ 8-10 разів на рік). Зареєстровані у 77 дітей (28,1%) знижені показники СКЦ були розцінені як ложнозаніженние, т. К. Вони не підтверджувалися ні анамнестически, ні при спостереженні в динаміці (частота ГРЗ 1-2 рази на рік; відсутність інших захворювань, зокрема пухлин , лейкозів і т.д., які могли б зумовити низькі показники СКЦ).

Нормальні значення СКЦ, виявлені у 116 дітей (42,3%), були підтверджені клінічно (аналогічно заявленому способу) тільки у 110 дітей (40,1%). У 5 дітей (1,8%) з числа зазначених 116 отримані результати визначення були розцінені як ложнозавишенние, тому що в анамнезі відзначалися часті ГРЗ (8-10 разів на рік), а в однієї дитини (0,4%) зареєстрована нормальна СКЦ була розцінена як ложнозаніженная в зв'язку з наявністю глистной інвазії, яка може, як було зазначено вище, обумовити підвищену активність цитотоксичних клітин. У 13 дітей (4,8%) була відзначена підвищена СКЦ, яка була розцінена як ложнозавишенная, тому що 4 дитини (1,5%) виявилися практично здоровими, а у 9 дітей (3,3%) в анамнезі відзначалися часті респіраторні захворювання (частота ГРЗ більше 8 разів на рік).

У групі В підвищена СКЦ була визначена за допомогою способу-прототипу тільки у 4-х з 7 хворих, у яких був зареєстрований клінічний криз відторгнення трансплантата. У 3-х хворих з кризом відторгнення пересадженого шкірного клаптя були отримані нормальні значення СКЦ, розцінені як ложнозаніженние. З 5-ти хворих з пересадженим шкірним трансплантатом без відторгнення останнього у одного пацієнта відзначалися знижені показники СКЦ, які корелювали з клінічними даними (частота ГРВІ - 9 захворювань за попередній опіку рік), а у 4-х пацієнтів отримані значення СКЦ знаходилися в межах норми . При цьому у 3-х хворих (з числа зазначених 4-х пацієнтів) нормальні значення СКЦ були підтверджені клінічно, а в однієї дитини отримані результати були розцінені як ложнозавишенние (в анамнезі - частота ГРВІ 8 разів на рік).

Дані таблиці 4 показують і, що тривалість процедури визначення СКЦ з використанням заявленого способу склала 2-2,5 год, тоді як при використанні способу-прототипу аналогічний показник склав 88-90 год.

Таким чином, заявлений спосіб при його реалізації забезпечує підвищення точності визначення СКЦ в порівнянні зі способом-прототипом: кількість результатів визначення, корелюють з даними клінічного обстеження, зростає на 35%, при відсутності ложнозаніженних і ложнозавишенних результатів визначення (на відміну від способу-прототипу, де ложнозаніженние і ложнозавишенние результати становлять відповідно 28,3 і 6,7%). При цьому тривалість процедури визначення при використанні заявленого способу скорочується в 35-45 разів (у порівнянні зі способом-прототипом). Крім того, виключення з ходу аналізу дій, пов'язаних з міченням матеріалу радіоактивним ізотопом, дозволяє виключити необхідність спеціально обладнаній лабораторії і спеціально навченого персоналу, що спрощує спосіб.

ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ

1. Лімфоцити: Методи. Пер. з англ. / Под ред. Дж. Клауса. - М .: Світ, 1990. - С. 223-226,269.

2. Імунологічні методи. / Під. ред. Г. Фримель, Пер. з нім. А.П. Тарасова. - М .: Медицина, 1987. - С. 282-293.

3. Ярілін А.А. Основи імунології: Підручник. - М .: Медицина, 1999. - С. 51-54, 421-432.

4. Зарецька Ю.М. Клінічна імуногенетика. - М .: Медицина, 1983. - С. 159-162 (прототип).

5. Довідник з функціональної діагностики в педіатрії. / Под ред. Ю.Є. Вельтіщева, Н.С. Кисляк. - М .: Медицина, 1979. - С. 455-462.

6. Фрейдлін І.С. Імунна система та її дефекти: Керівництво для лікарів. - СПб., 1998. - С. 25-27.

7. Кетлінський С. А., Калініна Н.М. Імунологія для лікаря. - СПб .: ТОВ видавництво "Гіппократ", 1998. - С. 9, 113-115.

8. Гублер Є.В. Обчислювальні методи аналізу та розпізнавання патологічних процесів. - Л .: Медицина, 1978. - С. 84-86.

9. Зеліченко Л.І. Гладкі клітини щурів в алергічних реакціях негайного типу: Автореф. дис. на соіск. вчений. ступеня канд. мед. наук. - М., 1969. - 18 с.

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб визначення спонтанної клітинної цитотоксичності, що включає виділення мононуклеарів з периферичної крові пацієнта, приготування клітин-мішеней, змішування мононуклеаров і клітин-мішеней, инкубирование суміші мононуклеарів і клітин-мішеней з подальшим урахуванням результатів цитотоксической реакції, що відрізняється тим, що в якості клітин- мішеней використовують гладкі клітини щурів, змішують мононуклеари і огрядні клітини щурів в співвідношенні 20-30: 1, безпосередньо після змішування мононуклеаров і огрядних клітин щурів додатково центрифугируют отриману суміш, инкубирование суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів виробляють протягом 30 хв, а облік результатів цитотоксической реакції здійснюють шляхом підрахунку кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів у відсотках від загальної кількості огрядних клітин щурів в суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів і при значенні цього показника, що становить менше 25%, визначають знижену спонтанну клітинну цитотоксичність, при значенні цього показника 25-35% визначають нормальну спонтанну клітинну цитотоксичність, а при значенні цього показника понад 35% визначають підвищену спонтанну клітинну цитотоксичність.

2. Спосіб за п.1, що відрізняється тим, що в ході обліку результатів цитотоксической реакції безпосередньо перед підрахунком кількості дегрануліровавшіх огрядних клітин щурів в суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів виробляють перемішування клітинного осаду і супернатанта суміші мононуклеарів і огрядних клітин щурів.

Версія для друку
Дата публікації 02.04.2007гг

НОВІ СТАТТІ ТА ПУБЛІКАЦІЇ
	Технологія виготовлення універсальних муфт для бесварочного, безрезьбовиє, бесфлянцевого з'єднання відрізків труб в трубопроводах високого тиску (мається відео)
	Технологія очищення нафти і нафтопродуктів
	Про можливість переміщення замкнутої механічної системи за рахунок внутрішніх сил
	Світіння рідини в тонких діелектричних каналох
	Взаємозв'язок між квантової і класичної механікою
	Міліметрові хвилі в медицині. Новий погляд. ММВ терапія
	магнітний двигун
	Джерело тепла на базі нососних агрегатів