| початок розділу
Виробничі, аматорські радіоаматорські Авіамодельний, ракетомодельного Корисні, цікаві |
хитрощі майстру
електроніка фізика технології винаходи |
таємниці космосу
таємниці Землі таємниці Океану хитрощі Карта розділу |
  |
| Використання матеріалів сайту дозволяється за умови посилання (для сайтів - гіперпосилання) | |||
Навігація: => |
На головну / Каталог патентів / В розділ каталогу / Назад / |
|
ВИНАХІД
Патент Російської Федерації RU2104526
СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ Т-клітинних ЛІМФОМ ШКІРИ
Ім'я винахідника: Коган Еммануїл Маркович; Жукоцкая Олександр Васильович; Копилов Віктор Федорович; Лезвінская Олена Михайлівна; Черниш Сергій Анатолійович
Ім'я патентовласника: Коган Еммануїл Маркович; Жукоцкая Олександр Васильович; Копилов Віктор Федорович; Лезвінская Олена Михайлівна; Черниш Сергій Анатолійович
Адреса для листування:
Дата початку дії патенту: 1995.05.05
Використання: винахід відноситься до медицини, а саме, до дерматології і гематології, призначене для ранньої діагностики і диференціальної діагностики T-клітинних лімфом шкіри. Спосіб діагностики T-клітинних лімфом шкіри (ерітродермічеський варіантів) шляхом цитологічного аналізу взятого у хворого біологічного матеріалу, який відрізняється тим, що в якості біологічного матеріалу беруть мазок крові, фіксують, проводять рібонуклеазную обробку, фарбують галлоціанін-хромовими галуном, мікроденсітометріруют інтерфазна хроматин лімфоцитів, на підставі отриманих параметрів (OD4 - оптична щільність еухроматину; FORM_P - форм-фактор ядра; IOD2 - інтегральна оптична щільність гетерохроматина; AREA - площа ядра) розраховують показник: DF = -0,14379 Ч OD4 + 0,00003 Ч IOD2 + 10,4952 Ч FORM_P + 0,0001 Ч AREA - 11,1241 і при негативному значенні цього показника діагностують T-клітинну лімфому шкіри.
ОПИС ВИНАХОДИ
Винахід відноситься до медицини, а саме, до дерматології і гематології, призначене для ранньої діагностики і диференціальної діагностики T-клітинних лімфом шкіри.
Найбільш часто доводиться диференціювати ерітродерміческом варіанти T-клітинних лімфом шкіри і еритродермії, що виникають при доброякісних запальних дерматозах (екземі, псоріазі, нейродерміті та ін.). Крім того, до теперішнього часу не дана оцінка змін в лімфоцитах у хворих з ерітродерміческом станами, які визначаються як предлімфомние: ексфоліативнийдерматит Вільсона-Брока і червоний висівковий лишай Гебр. У клінічній практиці нерідко доводиться вирішувати питання про злоякісної трансформації в лімфому хронічних запальних дерматозів.
Існуючі методи діагностики T-клітинних лімфом шкіри не можуть повністю задовольнити клініцистів, так як дозволяють встановити діагноз тільки при наявності вираженої клінічної картини, трудомісткі у виконанні (імунологічні, цитохімічні, цитогенетичні та ін.) І достовірно не відображають зміни в популяції лімфоцитів, що характеризують злоякісність процесу.
Одним з найбільш відомих діагностичних методів є виявлення атипових форм лімфоцитів у хворих еритродермії при злоякісних T-клітинних лімфомах. До цих еритродермій відносять ерітродерміческом форму грибовидного микоза та синдром Сезарі, який в даний час розглядається як лейкемічний варіант ерітродерміческой форми грибоподібної мікозу.
Раніше були спроби опису атипових Т-лімфоцитів (клітин Сезарі) у хворих еритродермії. Однак, кожен з нижче перерахованих методів має свої недоліки.
Гістологічна картина ерітродермічеський станів далеко не завжди відображає нозологическую специфічність процесу, з огляду на вираженого запального компонента біопсії. Нерідко для постановки діагнозу потрібно кілька біопсій, що травматично для хворого.
Світлова мікроскопія дозволяє виявляти атипові лімфоцити в периферичної крові лише в запущених стадіях захворювання, крім того, так як аналіз проводиться візуально, то результатом є якісне опис морфології, що не дозволяє об'єктивізувати і кількісно оцінити отримані результати [1].
Електронно-мікроскопічні дослідження дозволяють отримати загальні уявлення про розподіл хроматину у лімфоцитах, але методика не дозволяє оцінити функціональний стан геному, досить трудомістка, особливо в підготовці матеріалу для дослідження [2],
Скануюча електронна мікроскопія не може застосовуватися в діагностиці ерітрoдермій, оскільки не дозволяє отримати інформацію про зміни ядер лімфоцитів, специфічних для діагностики [3].
Цитохімічні дослідження не дають чіткої різниці у змісті ферментів в реактивних Т-лімфоцитах при доброякісних запальних дерматозах і злоякісних T-лімфомах, тобто немає специфічних цитохимических маркерів клітин Сезарі [4].
Цитофотометрія лімфоцитів відображає їх проліферативну активність на підставі визначення клітин, що включають тимидин тільки в S-фазу і не відображає якісне перерозподіл хроматину в кожній клітині [5].
Цитогенетичні дослідження не мають суворої специфічності і не завжди виявляють патологічні зміни навіть при далеко зайшли процесах [6].
Морфометрія лімфоцитів показує, що ступінь порізаності ядра, певна по співвідношенню окружності ядра, становить індекс ядерного контуру, який був найбільшим у клітин Сезарі і найменшим у лімфоцитів хворих на хронічний лімфолейкоз. Але застосування тільки методу класичної морфометрії не дозволяє оцінити тонку структуру надмолекулярной організації хроматину в ядрі [7].
Імуно-фенотипическая характеристика із застосуванням моноклональних антитіл, які виявлятимуть специфічні пухлинні маркери на мембранах лімфоцитів, є найбільш інформативною для діагностики проявів T-клітинних лімфом та диференціальної діагностики їх з доброякісними запальними захворюваннями шкіри. Однак, дана методика вимагає наявність дорогих реактивів, дозволяє діагностувати T-клітинні лімфоми на більш пізніх стадіях захворювання, коли виражені інфільтрація шкіри і лімфаденопатія, ніж метод, пропонований в даній заявці, а й є складнощі в підготовці матеріалу для дослідження, тому що кров береться з вени, що більш травматично для хворого з ураженням шкіри [8].
Цей метод можна розглядати як прототип, оскільки він є найбільш інформативним для діагностики T-клітинних лімфом та диференціальної діагностики їх з доброякісними запальними захворюваннями шкіри.
Постановка реакції здійснюється в 3 етапи.
I. Виділення і підготовка лімфоцитів для постановки реакції.
Забір крові з ліктьової вени і виділення лімфоцитів за звичайним способом на градієнті щільності ФЕКО-верографина центрифугуванням. Підрахунок клітин здійснюється в камері Горяєва.
II. Підготовка і проведення реакції непрямої імунофлюоресценції.
На чисті знежирені скла наносять лунки з парафільма, по 4 на кожного хворого. У кожну лунку наносять полі-L-лізин для фіксації клітин. Препарат инкубируют в термостаті 40 хв при 37 o C. Постановка реакції складається з послідовних інкубації. Спочатку - з суспензією клітин, потім препарати відмивають і в лунки наносяться моноклональні антитіла. Після промивання для видалення антитіл, препарати інкубують з антисироваткою проти Ig G миші, леченой флюоресцеином ізотіоцианатом. Потім після відмивання препарати заливають гліцерином, змішаним з фізіологічним розчином (1: 1) і накривають покривним склом.
III. Підрахунок субпопуляцій Т-лімфоцитів в люмінесцентному мікроскопі, оснащеному фазово-контрастним пристроєм.
Визначають ставлення клітин, що мають кільцеве світіння, до загальної кількості клітин, підрахованому в фазово-контрастному пристрої, виражене у відсотках, що відображає зміст певних фенотипических популяцій і дозволяє віднести досліджуваний матеріал до певної нозологічної формі (T-лімфопроліферірующій процес). Дифузно-пофарбовані (загиблі) клітини не враховуються.
Метою даного винаходу є розробка способу більш ранньої діагностики та диференціальної діагностики T-клітинних лімфом шкіри (ерітродермічеський варіантів) і зниження травматизації хворого.
Спосіб здійснюється наступним чином
Готують мазок периферичної крові, взятої з пальця руки, фіксують (наприклад, сумішшю Никифорова: етанол і ефір у співвідношенні 1: 1) протягом 15 - 20 хв, висушують на повітрі. Проводять рібонуклеазную обробку, рибонуклеаза (Reanal, BHP) розлучається в осмолярність розчині сахарози в концентрації 200 ME / 100 мл. Обробка триває 50 - 60 хв при температурі 37 o C, після чого мазок промивають в 3-х змінах дистильованої води. Фарбування роблять у розчині галлоціанін-хромових квасцов (ДХК), приготованому за стандартною методикою [9] протягом 3 - 4 год при 37 o C. Препарат промивають 4 - 5 хв відстояною водопровідною водою.
Після забарвлення препарат накривають покривним склом і проводиться мікроденсітометріческое дослідження на системі аналізу зображень. Результатом мікроденситометри є оптичні, топологічні та геометричні характеристики интерфазного хроматину по компонентах (еухроматин і гетерохроматин) і ядра в цілому.
Попередньо на навчальних вибірках були встановлені найбільш інформативні для даної патології показники структури интерфазного хроматину:
OD4 - оптична щільність еухроматину;
FORM_P - форм-фактор ядра;
IOD2 - інтегральна оптична щільність гетерохроматина;
AREA - площа ядра.
Для комплексної оцінки цих показників розраховується параметр: DF = -0,14379 Ч OD4 + 0,00003 Ч IOD2 + 10,4952 Ч FORM_P + 0,0001 Ч AREA - 11,1241.
Формула для розрахунку параметра DF отримана застосуванням лінійного дискримінантного аналізу [10] за допомогою стандартного пакета статистичних програм. При від'ємному значенні показника DF діагностують T-клітинну лімфому шкіри.
Подібну зв'язок між чисельними значеннями встановили при обстеженні груп хворих, які перебувають на лікуванні в шкірної клініці Моніка з приводу T-клітинної лімфомою шкіри (11 осіб) і доброякісних запальних дерматозів (псоріаз і нейродерміт - 10 осіб). В результаті проведеного аналізу виявили найбільш значущі показники структури интерфазного хроматину лімфоцитів периферичної крові, розрахували похідний параметр DF для виявлення T-клітинної лімфоми шкіри.
Приклад 1. Хворий Б ,, 63 років, N історії хвороби - 7646, Моніка.
Поступив в клініку зі скаргами на почервоніння шкіри, свербіж, печіння, озноб.
Клінічний діагноз: T-клітинна лімфома шкіри, ерітродерміческая стадія.
Під час лікування в клініці пропонованим в даній заявці способом був досліджений хроматин інтерфазних ядер лімфоцитів периферичної крові хворого, при цьому використовувалася стандартна методика приготування мазка цільної крові, взятої з пальця руки. Отриманий мазок висушували на повітрі, фіксували сумішшю Никифорова. Далі для усунення впливу рибонуклеїнової кислоти на результати сканування проводили рібонуклеазную обробку. Рибонуклеазу розводили в осмолярність розчині сахарози в концентрації 2000 E на 100 мл розчину. Препарати обробляли в цьому розчині протягом 1 год при 37 o C, після чого їх промивали в 3-х змінах дистильованої води. Далі проводили фарбування препаратів в розчині ДХК. Розчин ДХК готується за стандартною методикою [9]. Фарбування проводиться протягом 3 ч в термостаті при 37 o C, після чого препарати промивали 5 хв відстояною водопровідною водою.
Пофарбовані препарати укладали в канадський бальзам і після висушування досліджували на системі аналізу зображень.
Показники структури хроматину для обстеженого хворого:
OD4 - 3,02207; FORM_P - 0,82145; IOD2 - 39080,8; AREA - 7938,7.
Далі для комплексної оцінки був розрахований показник DF = -0,9710674,
Значення показника DF <0; отже, у хворого виявлені зміни структури интерфазного хроматину відповідні T-клітинної лімфоми шкіри, що повністю збігається з даними клінічних та лабораторних досліджень.
Приклад 2. Хворий В., 40 років, N історії хвороби 14762, Моніка.
Вступив в шкірну клініку Моніка зі скаргами на почервоніння шкіри, більше на нижніх кінцівках, свербіж.
Клінічний діагноз: Нейродерміт.
За допомогою запропонованого способу досліджується структура хроматину лімфоцитів периферичної крові хворого (див. Приклад 1.).
Показники структури хроматину для обстеженого хворого:
OD4 - 4,48286; FORM_P - 0,938331; IOD2 - 74411,4; AREA - 13686.
Далі для комплексної оцінки був розрахований показник DF = 1,6802235.
Значення показника DF> 0, отже, виявлені зміни структури хроматину відповідають змінам при доброякісних запальних дерматозах.
Приклад 3. Хворий Г., 56 років, N історії хвороби - +1497; Моніка.
Поступив в клініку зі скаргами на почервоніння шкіри, озноб.
Клінічний діагноз: псоріаз.
За допомогою запропонованого способу досліджується структура хроматину лімфоцитів периферичної крові хворого (див. Приклад 1.).
Показники структури хроматину для обстеженого хворого:
OD4 - 3,26156; FORM_P - 0,933456; IOD2 - 79238,4; AREA - 14092,6.
Далі для комплексної оцінки був розрахований показник DF = 1,9901397.
Значення показника DF> 0, отже, виявлені зміни структури хроматину відповідають змінам при доброякісних запальних дерматозах.
Приклад 4. Хвора Д., 48 років, N історії хвороби - 16105, Моніка.
Надійшла в клініку зі скаргами на зміну кольору шкіри (почервоніння), свербіж, озноб, печіння, поколювання. Хвора з дитинства, зазначає сезонні рецидиви кожну весну й осінь, останні 3 роки без ремісії. Раніше лікувалася антигістамінними препаратами з приводу атонического дерматиту.
Клінічний діагноз на момент надходження: T-клітинна лімфома шкіри.
Клінічні дані при надходженні: шкірні покриви застійно-синюшного кольору, 100% еритродермія, виражена інфільтрація, збільшені всі групи периферичних лімфовузлів, особливо стегнові та пахові (до 4 - 5 см).
За допомогою запропонованого способу досліджується структура хроматину лімфоцитів периферичної крові хворої (див. Приклад 1.).
Показники структури хроматину для обстеженої хворий:
OD4 - 4,78724; FORM_P - 0,944441; IOD2 - 66646,9; AREA - 11071,9.
Далі для комплексної оцінки був розрахований показник DF = 1,206237183.
Значення показника DF> 0, отже, виявлені зміни структури хроматину відповідають змінам при доброякісних запальних дерматозах.
При обстеженні в клініці в мазках периферичної крові у хворої виявлені одиничні клітини Сезарі (бласти, подібні крупноклеточной варіанту), але за висновком біопсійного дослідження - нейродерміт (типовий).
На тлі лікування тавегілом, активованим вугіллям, гемодез, клерітіном у хворої відзначено поліпшення самопочуття, зменшення еритеми та інфільтрації шкіри.
Таким чином, проведені клінічні обстеження хворий і ефективність терапії підтвердили наявність у хворої доброякісного запального дерматозу (нейродерміту).
Приклад 5. Хвора П., 80 років, N історії хвороби - 9743, Моніка.
Надійшла в клініку зі скаргами на свербіж, почервоніння шкіри, озноб, поколювання, печіння. Хвора з 1970 року, раніше лікувалася преднізолоном з приводу алергічного дерматиту.
За 4 міс до справжнього надходження в клініку хвора обстежилася в шкірної клініці Моніка з передбачуваним діагнозом: ексфоліативнийдерматит Вільсона-Брока.
Результат гістологічного дослідження шкірного біоптату: зміни більш відповідають генералізованої еритродермії.
Клінічний діагноз на момент надходження: алергічний дерматит.
Клінічні дані при надходженні: шкірні покриви яскраво червоного кольору; виражена інфільтрація, 100% еритродермія, порідіння волосся, виражений гіперкератоз на долонях і підошвах, помірно збільшені пахвові, пахові і стегнові лімфовузли.
За допомогою запропонованого способу досліджується структура хроматину лімфоцитів периферичної крові хворої (див. Приклад 1.).
Показники структури хроматину для обстеженої хворий:
OD4 - 4,10798; FORM_P - 0,820714; IOD2 - 42548,7; AREA - 8391,45.
Далі для комплексної оцінки був розрахований показник DF = -0,9856234.
Значення показника DF <0; отже, виявлені зміни структури хроматину відповідають змінам при T-клітинної лімфоми шкіри.
При обстеженні в клініці виявлено зміни в периферичної крові (лімфоцитів - 72%, клітини Сезарі - 15%); при біопсії підтверджений діагноз T-клітинної лімфоми: cиндром Сезарі, дифузний інфільтрат з поліморфізмом, мікроабсцеси, в інфільтраті великі багатоядерні клітини.
Збіг результатів проведених тестів за допомогою запропонованого способу і клінічної картини захворювання говорить про специфічність способу діагностики T-клітинних лімфом шкіри (ерітродермічеський варіантів).
Таким чином, у порівнянні з прототипом запропонований спосіб ранньої діагностики і диференціальної діагностики T-клітинних лімфом шкіри дозволяє:
а) виявляти злоякісні форми лімфоцитів на більш ранніх стадіях, коли ще не виявляються клітини Сезарі і встановлювати діагноз до розвитку виражених клінічних проявів;
б) проводити диференційну діагностику ерітродермічеський станів при T-клітинних лімфомах шкіри і доброякісних запальних дерматозах;
в) знизити травматизацію хворого з захворюванням шкіри, так як кров для дослідження береться не з вени, а з пальця.
ВИКОРИСТАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Orbaneja JG, Vus ES, Diar-Flores L., Huarte PS, Cytology of the micosis fungoides and Sezary syndrome. - Brit. J. Derm. 1972, 87, 2, 96 - 105.
2. Персіна І. С. Клінічна морфологія злоякісних лімфом шкіри. - Автореф. дисс, докт. мед. наук .: - М. +1989.
3. Polliak A., Dialdettim, Reyes F. Surface Features of Sezary cells: a scanning Electron microscopy Study of 5 cases. - Scand, J, Haemat, 1977, 18, 3, 207 - 213.
4. Lennert К. S., Raiserbing E. Cytological and functional criteria for the classication of malignant lymphomata. - Br. J. Cancer 1975, 31, Suppl II, 29 - 49.
5. Vloten WA, Schaberg A., van der Ploegm. Cytometric studies on mycosis fungoides and other cutaneous retieulosis. - Bull. cancer 1977, 64,2, 249 - 258.
6. Dewald G., Spurbeck JL, Viteic MA Chromosomes in a patient with Sezary Syndrome. - Mago clin. Proc. 1974, 49, 8, 553 - 557.
7. Willemze R., Van. Vloten WA, Hermans J., Damstug MJM, Meifer CJLM Diagnostic criteria in Sezary syndrome: a multiparameter lymphosytes in 32 patients with erytroderma. - J. Invest. Derm. 1989, 81, 5, 392 - 397.
8. Hastrup N., Pallesen G., Ralfkiaer E. Use of monoclonal antibodies for the diagnosis of T-cell malignansies. Application and limitations. Leukemia / lymphoma 1990, 2, 35 - 45.
9. Пірс Е. Гистохимія. - М., 1962, с. 190 - 192, 746.
10. Афіфі А., ейзен С. Статистичний аналіз: підхід з використанням ЕОМ. Пер. з англ. - М .: Світ, 1982. - 488 с.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб діагностики Т-клітинних лімфом шкіри (ерітродермічеський варіантів) шляхом цитологічного аналізу, взятого у хворого біологічного матеріалу, який відрізняється тим, що в якості біологічного матеріалу беруть мазок крові, фіксують, проводять рібонуклеазную обробку, фарбують галлоціанін хромовими галуном, мікроденсітометріруют інтерфазна хроматин лімфоцитів, на підставі отриманих параметрів (OD 4) оптична щільність еухроматину, FORM_ P форм-фактор ядра; IOD 2 інтегральна оптична щільність гетерохроматина; AREA площа ядра), розраховують показник DF -0,14379 Ч OD 4 + 0,00003 Ч 1OD 2 + 10,4952 Ч FORM_P + 0,001 Ч AREP 11,1241 і при негативному значенні цього показника діагностують Т-клітинну лімфому шкіри.
Версія для друку
Дата публікації 01.04.2007гг
Коментарі
Коментуючи, пам'ятайте про те, що зміст і тон Вашого повідомлення можуть зачіпати почуття реальних людей, проявляйте повагу та толерантність до своїх співрозмовників навіть у тому випадку, якщо Ви не поділяєте їхню думку, Ваша поведінка за умов свободи висловлювань та анонімності, наданих інтернетом, змінює не тільки віртуальний, але й реальний світ. Всі коменти приховані з індексу, спам контролюється.